[發明專利]一種動態調控脂肪酸代謝途徑強化柚皮素合成的方法

有效

• 申請號: 201911354531.X
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110982770B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;周勝虎;鄧禹;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種動態調控脂肪酸代謝途徑強化柚皮素合成的方法動態調控策略調節脂肪酸代謝途徑積累丙二酰?CoA，并進一步強化柚皮素合成的方法，屬于代謝工程技術領域。本發明以柚皮素響應蛋白FdeR為基礎，利用基因過表達技術和反義RNA抑制技術等調控手段，結合組成型表達柚皮素合成途徑，從而建立了一種可感應胞內柚皮素含量的動態循環放大系統，強化柚皮素合成，使柚皮素產量提升到原來的3.2倍，達95.1mg/L。本發明實現了細胞生長和產物合成之間的平衡，所述方法為其他高附加值化合物生產菌株的代謝工程改造提供方法借鑒。

技術領域

本發明涉及一種動態調控脂肪酸代謝途徑強化柚皮素合成的方法，屬于代謝工程技術領域。

背景技術

黃酮類化合物是一類廣泛存在與植物組織中的天然產物，具有多種生理功能，如抗癌、抗炎癥、抗衰老、調節人體激素水平、抗氧化和保肝護肝等功能，已經被廣泛應用于食品和藥品中。所有黃酮類化合物都含有三個碳原子連接兩個苯環所構成的核心骨架。柚皮素是一種具有最多衍生物的黃酮骨架類物質，經過對柚皮素的后續化學或酶法催化修飾，適當的羥基化、甲基化、糖基化等催化反應，即可生成具有更高附加值和功能多樣的黃酮類化合物。

大腸桿菌合成柚皮素等黃酮類化合物過程中，胞內丙二酰-CoA的供給不足是導致最終產量較低的重要原因。胞內丙二酰-CoA絕大部分流向脂肪酸合成途經。此外丙二酰-CoA的前體物質乙酰-CoA大部分進入TCA循環，為菌體生長提供必需的能量。這些都導致了較低的丙二酰-CoA胞內含量。利用代謝工程手段過多的積累胞內丙二酰-CoA不僅會影響菌體生長，還會造成胞內過多的脂酰-CoA衍生物積累，從而進一步影響細胞整體蛋白組的酰基化水平。目前已有報道中，研究者主要通過抑制胞內脂肪酸合成途徑積累丙二酰-CoA。Leonard等通過添加淺藍菌素抑制脂肪酸合成相關基因(fabB/fabF)，分別得到700mg/L和113mg/L的黃酮和花青素。通過強化丙二酰-CoA合成途徑來積累丙二酰-CoA同樣獲得了較大進展。Leonard等和Zhu等通過過表達來自谷氨酸棒狀桿菌的乙酰-CoA羧化酶(ACC)極大地提升了黃酮類化合物的產量。

然而，上述靜態調控系統調控丙二酰-CoA合成需要在合適的時間添加誘導劑，誘導時間、誘導劑濃度和菌體的生長狀態等都對最終產量具有較大影響。同時，由于丙二酰-CoA與細胞生長息息相關，過量積累丙二酰-CoA不僅會嚴重影響細胞生長，還會影響細胞的蛋白質組酰基化水平而進一步改變胞內代謝環境。因此，構建穩定、高效、可動態調節細胞生長和產物合成的柚皮素生產平臺菌株至關重要。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種動態響應柚皮素含量調控脂肪酸合成途徑的方法，強化胞內丙二酰-CoA積累，從而進一步強化柚皮素合成。

本發明的第一個目的是提供一種動態響應柚皮素含量調控脂肪酸合成途徑的方法，是利用動態響應柚皮素含量的生物傳感器調控脂肪酸合成途徑，所述生物傳感器包括柚皮素響應的調控蛋白FdeR和受FdeR調控的啟動子P_fdeA，所述調控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述調控蛋白FdeR的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子P_fdeA包括P_fdeA(180-1)、P_fdeA(223-1)、P_fdeA(250-1)、P_fdeA(288-1)、P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)或P_fdeA(223-180+RBS)。所述P_fdeA(288-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。