[發明專利]菜豆凝集素檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201911353750.6
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN111458301A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 韓雪;陳禪友;陳高;陳澤才;余英;楊琳
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N27/447;G01N1/28;G01N33/53;G01N33/535
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了一種菜豆凝集素檢測試劑盒，所述的試劑盒含有菜豆凝集素卵黃抗體，該抗體可以特異性識別菜豆凝集素PHA?E及PHA?L兩種亞基。本發明利用酶聯免疫法定量檢測菜豆凝集素的含量，克服了現有檢測方法存在的菜豆凝集素的漏檢、檢測結果容易受凝血或抗凝血成分影響的不足。

技術領域

本發明屬于植物活性成分檢測技術領域，具體涉及一種用于定量檢測菜豆凝集素的檢測試劑盒。

背景技術

菜豆又叫四季豆、扁豆、蕓豆等，是我國主要蔬菜，多數地區春秋兩季栽培。由于進食貯存過久或烹調不當的四季豆，如水焯后做涼菜，或炒食時不夠熟透而未能充分滅活凝集素造成中毒，中毒事件多發生在集體食堂，據報道，菜豆中毒主要是由菜豆凝集素導致，菜豆凝集素是由4個分子量約30kD的亞基組成，分子量大小在128KD左右。菜豆凝集素亞基分別為紅細胞凝集素(PHA-E)和白細胞凝集素(PHA-L)，紅細胞凝集素有強紅細胞凝集活性，白細胞凝集素具有強白細胞凝集活性。菜豆中毒最重要的因素是由于菜豆凝集素中的紅細胞凝集素可與紅細胞表面特異糖基識別并專一性結合，使紅細胞發生凝集，白細胞凝集素也會特異性結合白細胞，使其發生凝聚，進而引起機體的整體反應。不同菜豆品種中，由于品種、產地、種植季節的不同，使不同菜豆中凝集素的含量不盡相同，因此快速檢測菜豆凝集素的活性，對低毒品種菜豆的選育提供指導。

現有菜豆凝集素檢測方法都是通過凝集素亞基中紅細胞凝集素(PHA-E)的紅細胞凝集實驗來檢測的。該方法一般利用兔紅細胞，配制成一定濃度的紅細胞懸液，將凝集素溶液經過稀釋后加入紅細胞懸液中，靜置一段時間后，利用肉眼觀察血細胞凝集效果的定性分析；或者以分光光度計及酶標儀測定的特定波長下吸光度的半定量分析方法。這些分析方法存在兩個重要的問題：第一，菜豆凝集素是由PHA-E、PHA-L亞基形成的四聚體，主要有5種形式：L4、L3E1、L2E2、L1E3、E4，而紅細胞聚集實驗時，只能檢測含PHA-E亞基的四聚體，L4不含可以聚集紅細胞的PHA-E亞基，不參與血細胞凝集反應，另外，血細胞聚合只有兩個或以上PHA-E亞基結合紅細胞才能聚合，E1L3四聚體對血細胞凝集反應也不敏感，因此現有檢測方法無法檢測L4、E1L3四聚體，檢測結果只反應E4、E3L1、E2L2三種四聚體含量，不能反應L4、E1L3兩種四聚體真實含量，因此，并不能真實反應幾種四聚體的真實含量；第二，紅細胞凝聚檢測方法中的紅細胞每次需要新鮮取兔子血，血液在冰箱保存最多只能兩周，因此要長期飼養兔子，而且每次使用前都需要把破裂的紅細胞洗去，并在顯微鏡下調整細胞濃度，因此使用起來非常麻煩；第三，紅細胞凝集實驗是非特異性的凝血實驗，因此，實驗過程中還會受到其它凝血物質或抗凝血物質的干擾；第四，紅細胞聚集實驗肉眼定性實驗中結果判斷主觀性強，分光光度計及酶標儀方法需要專業實驗室和人員才能操作。

針對現有菜豆凝集素檢測存在的缺陷，我們制備了針對菜豆凝集素的卵黃抗體，抗體可特異性識別菜豆凝集素PHA-E及PHA-L兩種亞基，因此5種形式L4、L3E1、L2E2、L1E3、E4均可以被特異性識別。此外，檢測過程不需要用到紅細胞，試劑可長期保存，檢測質量不會隨紅細胞質量改變或者其它而受到影響。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種菜豆凝集素定量檢測試劑盒，利用菜豆凝集素卵黃抗體特異性識別菜豆凝集素，特異性強，準確度高。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種菜豆凝集素檢測試劑盒，所述的試劑盒含有菜豆凝集素卵黃抗體和酶標記的兔抗雞IgY，還包括酶標板、菜豆凝集素標準樣品溶液、封閉液、洗滌液、底物顯色液和終止液。

進一步地，所述的菜豆凝集素卵黃抗體的制備方法如下：

(1)菜豆凝集素標準品免疫雞后，收集雞蛋，去蛋清留蛋黃；

(2)用硫酸銨沉淀法粗提菜豆凝集素卵黃抗體；

(3)用離子交換柱層析法純化卵黃抗體。