[發明專利]一種葉綠體中表達紫杉二烯的重組載體pLD-TS

有效

• 申請號: 201911345952.6
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN110951758B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 張劍鋒;鄭慶霞;謝小東;徐國云;金靜靜;王中;武明珠;羅朝鵬;曹培健;楊軍
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12P5/00
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

本發明屬于植物生物工程技術領域，具體涉及一種葉綠體中表達紫杉二烯的重組載體pLD?TS。該載體制備步驟包括：紫杉二烯合成酶基因TS基因獲得、載體構建、轉化驗證等步驟。該載體在煙草葉綠體中，以煙草葉綠體基因組上trnI和trnA為左右同源序列，利用Prrn啟動子調控篩選標記aadA基因，同時利用psbA基因的啟動子和5’UTR調控紫杉二烯合成酶基因TS的表達。發明人利用煙草作為異源宿主，借助基因工程手段對紫杉二烯合成途徑進行了重構。初步實驗結果表明，本申請在煙草葉綠體中高效表達異源合成了紫杉二烯，煙草轉化株葉片中紫杉二烯的含量最高可達127.69μg/g，表現出較好的應用前景。

技術領域

本發明屬于植物生物工程技術領域，具體涉及一種葉綠體中表達紫杉二烯的重組載體。

背景技術

紫杉醇 (Paclitaxel，商標名為Taxol) 是20世紀70 年代由Wani 等從Taxus brevifolia Nutt樹皮中提取出來的具有獨特抗癌作用的四環二萜類化合物。從1992 年獲得美國FDA 認證以來，紫杉醇以其獨特的抗腫瘤機制和顯著的抑制腫瘤的作用成為醫院臨床的首選抗癌藥物。目前臨床上主要用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤和頭頸部腫瘤、上胃腸道癌、小細胞性和非小細胞性肺癌的治療，對肺癌、大腸癌、腦瘤也都有一定療效。

迄今為止，用于臨床和科學研究的紫杉醇主要通過兩種方法獲得：一種來自各種紅豆杉科的紅豆杉屬植物樹皮的提取物。但紅豆杉生長緩慢，樹皮中紫杉醇的含量非常低（僅約為干重的萬分之一左右）。而由于紫杉醇的大量需求，這一生產方式對紅豆杉這一瀕臨滅絕的寶貴林木資源造成了毀滅性破壞。除此之外，通過全合成、植物細胞或組織培養、植物共生真菌發酵等方法獲得紫杉醇也正在進行研究。化學全合成由于工藝復雜、需要25至27步反應，并且由于其中幾步反應的收率特別低，因此造成該方法所制備的紫杉醇成本昂貴。而通過植物細胞或組織培養獲得紫杉醇方式，也因為產率太低，培養過程復雜不易控制，高產量難以維持等因素難于真正實現產業化。目前紫杉醇及其類似物的制備工藝主要為化學半合成法：利用紫杉醇中間體化合物10-去乙酰巴卡亭III 和巴卡亭III合成紫杉醇，但這兩種中間體均需從紫杉樹的可再生針葉或細胞培養物中提取。

合成生物學技術在天然化合物的生物合成方面的成功應用為紫杉醇的制備開辟了新的途徑。通過合成生物學，可以在遺傳背景清晰且遺傳操作簡單的異源宿主中重建目標產物的生物合成途徑，新建的合成途徑與宿主原有的代謝途徑組成全新的代謝網絡，以此來合成特定的目標產物。針對植物活性代謝物的研究，一直是合成生物學領域的熱點，其中植物底盤的優勢及植物合成生物學的必要性越來越受到重視。其中煙草即是一種重要的植物生物反應器，而且由于煙草具有遺傳轉化體系成熟、表達水平高、生產成本低、規模化生產能力強、生產周期較短等優點，近年來，已有較多研究人員已經開始嘗試在煙草體內通過重組代謝途徑合成有價值的復雜代謝物中間體或終產物。基于此，如果能以煙草來制備紫杉醇、或者紫杉醇的相關的前體物，則可望大幅降低紫杉醇的生產成本。

發明內容

紫杉二烯是紫杉醇生物合成途徑中的關鍵前體之一，本發明目的在于提供一種可以在葉綠體中表達紫杉二烯的重組載體pLD-TS，基于此重組載體可以建立一種利用葉綠體生產紫杉二烯的方法，從而為紫杉醇的制備奠定一定技術基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種葉綠體中表達紫杉二烯的重組載體pLD-TS，通過如下步驟制備獲得：

（1）構建葉綠體表達載體pLD-MCS