[發明專利]引物探針組合、試劑盒及其用于檢測ACTN3基因突變的應用

在審

• 申請號: 201911343871.2
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN111073958A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 張棟;史東林;柴建中;趙寧寧;楊澤宇;楊丹
• 申請（專利權）人: 河北省體育科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京一枝筆知識產權代理事務所(普通合伙) 11791
• 代理人: 張慶瑞

本發明涉及生物技術領域，特別涉及引物探針組合、試劑盒及其用于檢測ACTN3基因突變的應用。本發明利用連接酶反應提高了單堿基錯配的識別能力，利用LAMP獲得高靈敏度，從而建立了基于連接酶的LAMP檢測SNP的新方法，該方法可以檢測到濃度為100aM的DNA。同時我們將此方法應用于人全血基因組DNA樣品檢測，獲得了與DNA測序一致的結果；該方法對基因突變具有很高的選擇性，可測定0.1％突變頻率。例如選拔優秀運動員時，需進行能力評定，可以通過檢測其血液中有氧能力、代謝效率、訓練敏感性、心臟猝死和運動損傷風險等相關基因的SNP類型，對其未來運動能力水平和運動風險進行預測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及引物探針組合、試劑盒及其用于檢測ACTN3基因突變的應用。

背景技術

人類基因組中最常見的基因突變是SNP。人類基因組中總共有300萬個 SNP，平均每1000個堿基中就有一個SNP，所以SNP是人類基因組中密度最大的遺傳標記。SNP發生頻率較高，被認為是繼微衛星之后的新一代遺傳學標記，在醫學遺傳學、藥物遺傳學、疾病遺傳學、疾病診斷學以及人類進化等研究領域都有著很高的研究價值和應用前景。ACTN3基因的SNPs與人體運動能力潛在相關，ACTN3R77X是ACTN3基因位于rs1815739位置的多態性，控制了α-肌動蛋白-3的合成，這是一種Z結構蛋白，主要存在于快肌肉纖維中，通過加速糖酵解和促進“爆發性”強收縮為肌肉提供能量。ACTN3突變純合子因為基因突變造成了α-肌動蛋白-3早期停止密碼子完全缺失，導致蛋白表達喪失，使得肌肉代謝向更有效的有氧途徑轉移，從而提高身體內在耐力性能。最近對運動員和普通人群的研究進一步表明，ACTN3基因還影響骨骼肌對運動訓練的適應性反應。檢測ACTN3基因的SNP是評價運動員耐力水平和訓練的有效手段之一。

在SNP分析中，往往根據實際樣品的性質和不同實驗目的來確定檢測方法。SNP檢測方法有多種。在運動科學實驗研究中，大多數檢測都采用常規方法，如PCR-RFLP和Sanger測序法，這些方法靈敏度高，但操作復雜，分析成本較高。目前，SNP檢測主要用PCR、RCA等DNA擴增方法對樣品進行信號放大，然后用實時熒光定量PCR進行信號檢測，結合了熒光染料放大能力和擴增的高靈敏度，但也存在一些缺點，如操作復雜、選擇性低及需要高精確度的溫度循環儀器等。環介導等溫擴增技術(LAMP)是目前核酸分析的最靈敏的技術，最低可以檢測到低于10個拷貝的DNA分子，而且是等溫擴增，不需要熱循環過程，但存在一些不足之處，一是對單堿基錯配的識別能力不高，二是需要將目標序列分為六個區域，設計四個特異性擴增引物，引物設計還要考察二級結構，保證擴增的特異性。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種引物探針組合、試劑盒及其用于檢測ACTN3 基因突變的應用。本發明基于連接酶的LAMP方法為SNP檢測提供了一種全新的恒溫、均相、無標記、高靈敏檢測技術，從而實現運動員基因型的高效檢測和運動訓練學評價。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了引物探針組合，所述引物包括FIP、BIP、Primer F和Primer R；所述探針包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和 Probe-mutant-B；

所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

所述Primer F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述Primer R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；