[發明專利]基于納米孔測序平臺的痰液樣本建庫方法、鑒定方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201911343496.1
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN111304287B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 張燁;程晨;周水蓮;梁曉雪;胡龍;李杜衡;涂浩波;任用
• 申請（專利權）人: 北京先聲醫學檢驗實驗室有限公司;江蘇先聲醫學診斷有限公司;南京先聲醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 李雙艷

本發明涉及基于納米孔測序平臺的痰液樣本建庫方法、鑒定方法及試劑盒。本發明所述方法是基于納米孔測序平臺結合不完全去宿主，對人體和動物體宏基因組樣本進行去宿主前處理以及樣本建庫，進而用于宏基因組的測序鑒定。本發明所述方法相比于傳統流程更簡易快捷且滿足合理檢出需求，省略鑒定過程中建庫PCR等流程，排除因PCR擴增導致的偏向性，能夠更加真實準確地鑒定宏基因組微生物。

本分案申請是基于申請號為201811528417.X，申請日為2018年12月13日，發明名稱為“基于納米孔測序平臺的宏基因組樣本建庫方法、鑒定方法及試劑盒”的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及宏基因組鑒定領域，具體而言，涉及基于納米孔測序平臺的痰液樣本建庫方法、鑒定方法及試劑盒。

背景技術

宏基因組測序鑒定相較于傳統的培養鑒定方法，具有鑒定周期短、對操作及鑒定人員的技術水平要求低等優勢。而且宏基因組測序克服了很多不能培養的微生物的鑒定弊端，被越來越多地應用于微生物鑒定中，特別是不明原因病原微生物的鑒定。目前主流的宏基因組測序方法主要是高通量測序方法，包括二代測序和三代測序。二代測序鑒定存在不少問題，比如：二代測序的鑒定通常從樣本到結果的周期較長(72h)；測序讀長短，增加生信拼接的難度和時長；測序儀投入大，通常需要多樣本合并測序以降低成本；三代測序如納米孔測序以其包括超長序列讀長、實時數據產生和生信分析和設備小巧便攜等卓越的特征，似乎已是目前比較快捷方便的宏基因組研究方法。

但無論是二代測序還是三代測序，高通量測序都是基于樣本基因組的，但在大多數的臨床樣本中，由于炎癥反應等，往往存在大量宿主DNA，病原體DNA只占很少的一部分。因此，得到的測序數據中只有很小的一部分能夠用于真正的物種和耐藥基因鑒定，并且從大量的原始數據中通過生物信息學方法，過濾掉宿主序列需要大量的計算能力且耗時較長，也會影響臨床樣本中低豐度病原體鑒定的敏感性。

目前基于納米孔測序平臺開發的快速鑒定流程中，英國的Grady教授(DOI:https://doi.org/10.1101/387548)團隊開發的針對感染樣本的濕實驗去宿主結合快速PCR條形碼合并建庫的流程是目前最為成熟的技術路線(見圖1)。Grady的方法，首先通過破壞宿主細胞膜游離宿主DNA，再通過鹽依賴的HL-SAN酶降解宿主DNA，離心收集細菌為主的微生物菌體，再針對細菌DNA進行提取，通常經過這個過程后得到的核酸量往往很低。因此，采用了起始量要求較低(1-5ng)的快速PCR建庫試劑盒，先通過轉座酶加上條形碼，再通過一步全基因組PCR擴增來提高DNA總量，最后通過快速接頭連接即可完成建庫，上機測序數據實時basecalling，2h的總數據即可成功完成鑒定細菌病原體。

但該方法存在幾個不足之處：

首先，在整個濕實驗過程中存在一些必須的純化步驟，所以整體流程并不像文章中呈現的可以在4h完成，根據實際檢驗，全流程需要5.5h完成；其次，由于去宿主DNA步驟盡量去除了樣本中絕大部分的宿主DNA，導致樣本的提取濃度往往極低。例如，在對于樣本建庫過程中由于PCR失敗而無法繼續建庫；更重要的是，由于建庫過程中存在的PCR步驟，無法避免地引入擴增偏向性，導致對于一些GC含量高的細菌的鑒定出現嚴重問題，菌種豐度比例嚴重失衡。

可見，本領域仍亟需一種更為高效便捷的宏基因組的鑒定方法。有鑒于此，特提出本發明。

發明內容