[發明專利]人類腸道病原菌感染診斷用鼠傷寒沙門菌特異性基因探針

在審

• 申請號: 201911343166.2
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN110846427A
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 黃新祥
• 申請（專利權）人: 江蘇意諾飛生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 連云港聯創專利代理事務所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 谷金穎

本發明公開了一種類腸道病原菌感染診斷用基因芯片鼠傷寒沙門菌特異性基因探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通過確定候選序列后，設計特異性引物，選用標準和臨床分離的野生菌株進行PCR調查和相應的序列分析驗證。根據驗證的病原菌特異性探針序列，設計合成引物并經PCR擴增相應的特異性核苷酸片段，每個長約200核苷酸，再通過重疊延伸PCR將某種病原菌的3至5個特異性片段擴增鏈接，以此作為各種病原菌特異性的探針。本發明將多個基因的高度特異區域串聯制成的探針，不但有較高的特異性，而且由于可同時與多個特異片段雜交使檢測的靈敏度大為提高。

技術領域

本發明涉及基因技術領域，具體為一種人類腸道病原菌感染診斷用鼠傷寒沙門菌特異性基因探針。

背景技術

腸道致病菌的傳統檢測方法是在細菌培養的基礎上，根據致病菌的生化反應及血清學試驗進行鑒定，目前還存在許多不足之處：(1)受條件限制，許多細菌如厭氧菌的培養只有極少數的實驗室能進行，大多數臨床檢驗實驗室存在漏檢的問題；(2)檢測周期長，尤其當遇到急性重癥病人，因不能及時獲得確切致病菌的診斷結果，往往對臨床用藥指導不力；(3)工作量大且效率低，我國微生物實驗室檢驗糞便最常用的培養基是Mac瓊脂和SS瓊脂，堿性蛋白胨水， 4號瓊脂等，主要針對沙門菌屬、志賀菌屬，弧菌屬的檢出，而對其他細菌的檢驗則需在上述選擇性培養陰性基礎上，再根據臨床醫生提供的臨床癥狀有針對性地選用其他特殊培養基進行檢驗；(4)漏檢真菌。因此，目前臨床微生物實驗室對腹瀉糞便中病原菌培養的陽性率較低。此外，目前三級醫院大都購置了進口的微生物鑒定系統，也是基于細菌培養和生化反應進行鑒定，它必須在適當的培養基上生長出致病菌，然后選擇適當的鑒定卡，孵育一段時間后，通過自動判讀致病菌的生化反應對細菌進行鑒定，同樣對有些細菌只能鑒定到屬，還需結合相應的血清學試驗才能鑒定到種。所以，用微生物鑒定系統檢測腸道致病菌省工不省時，也不能提高檢測的陽性率。在得不到確切的病原菌檢驗結果情況下，臨床醫師也只能據一般病癥采用抗菌藥的聯用，以期獲得良好的治療效果，此舉也是加劇腸道致病菌耐藥問題的主要原因。因此，迫切需要開展新技術的研究與應用，以提高腸道致病菌的檢測率，降低腸道病原菌感染對人類健康的威脅。

近年來隨著細胞和分子生物學的發展，許多常用的分子生物學技術，如PCR、多重PCR、熒光定量PCR等技術被臨床實驗室用于有關致病菌的檢測。運用PCR 檢測腸道感染的致病細菌時，雖有快速靈敏等優點，但也有易交叉污染，不能定量，一次只能檢測一個基因等缺點；熒光定量PCR雖然能快速定量，但一次仍然只能檢測一個基因(細菌)；多重PCR技術一次可檢測多個基因(細菌)，但由于是根據PCR產物分子大小來區分，所以一次檢測一般不超過6個基因(細菌)，即使是多重熒光定量PCR，其一次檢測的目的基因(細菌)數量仍受限制，一般不超過10個。

基因芯片分析技術在細菌分子流行病學調查、細菌基因鑒定、基因突變及多態性分析、基因表達譜分析等方面已有許多研究報道，在病原微生物檢測方面也有嘗試。以往研究發現，運用基因芯片直接檢測細菌時靈敏度較低，一次往往需要10^5～6菌量，為了提高靈敏度，多采用與PCR結合應用，如設計通用引物擴增各種細菌的保守基因，如16SRNA或23SrRNA基因，擴增產物經熒光標記后，再與芯片上固定的各種據保守基因的局部可變區設計的特異性探針進行雜交。利用此法雖可顯著提高檢測的靈敏度，但由于rRNA基因在同菌屬內不同菌種之間的差異很小，對屬內的種間區別很難。而且rRNA基因的二級結構和三級結構也常影響雜交效率，造成許多假陰性、假陽性結果。另外，也有基因芯片與多重PCR結合應用報道，據各種致病菌特異性標志基因，如毒性因子基因等制備芯片探針固定于芯片，利用特異引物對樣品先進行多重PCR擴增，并同標記時熒光，然后與基因芯片進行雜交。此法雖兼顧了檢測的特異性和靈敏度，但也有一定的局限性，主要是因為多重PCR擴增目的基因時，一次同時擴增的基因種類受限，因為引物對數量過多，引物間易形成二聚體影響擴增效率，因此在檢測是往往需對一份樣品進行數次多重PCR擴增，一定程度上削弱了基因芯片的高效性。因此，日前還沒有非常成熟的基因芯片用于臨床腸道致病菌的鑒別診斷。

發明內容