[發明專利]一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞分離和培養方法

有效

• 申請號: 201911342372.1
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110951675B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 宋紅梅;牟希東;汪學杰;周康奇;劉奕;劉超;胡隱昌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發明公開了一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞分離和培養方法，針對橘色雙冠麗魚黑色素細胞，選用了胰蛋白酶和膠原酶I共同處理，用胰蛋白酶預消化魚體表組織，去除表皮細胞，再用膠原酶I配制的膠原酶溶液進行二次處理，結合不同滴度濃度的percoll分層，獲得活力較高的色素細胞。成功傳代10代，細胞仍可以維持良好的生長狀態，而且可凍存和復蘇。為利用體外培養的黑色素細胞研究魚類體色形成的分子機理，為魚類體色分子育種提供技術支持和奠定理論基礎。

技術領域

本發明屬于水產動物技術領域，特別涉及一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞分離和培養方法。

背景技術

動物色素細胞是動物體色形成研究的重要載體。因此，能否成功提取、分離和體外培養色素細胞是探究動物體色基因生物學功能的基礎，也是了解魚類體色形成和體色變異分子機理的前提。1982年Eisinger等研究者使用0.25％胰酶消化處理人包皮后，再添加十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、霍亂毒素(CT)，首次提取、分離和體外培養了人黑色素細胞。Tamura通過人胚胎提取物和TPA成功從小鼠皮膚獲得黑色素細胞。白瑞采用Dispase II酶和0.02％胰酶/EDTA兩步消化處理提取和培養羊駝皮膚黑色素細胞。田穎剛以DMEM為培養基，采用胰蛋白酶、膠原酶I和中性蛋白酶消化并進行細胞產量和貼壁情況評估，添加TPA、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胎牛血清(FBS)獲得更具細胞產量和細胞活力的烏骨雞皮膚黑色素細胞。鮑加榮以K-SFM為培養基，加入TPA、BFE和bEGF等培養液，獲得了接近生理狀態的狐黑色素細胞。現有技術中，研究學者成功從哺乳動物如人、小鼠、羊駝和狐等皮膚分離和培養黑色素細胞，但難以從魚體體表中提取分離色素細胞，目前還未見確切的魚類某種色素細胞的單獨分離培養相關報道。

研究學者通常使用不同消化酶對鱗片組織進行消化處理，消化酶一般采用Dispase II酶、膠原酶I、中性蛋白酶和胰蛋白酶等處理，其中Dispase II酶相對來說對皮膚組織消化不太全面，多應用于研究哺乳動物眼睛黃色素細胞分離培養中；中性蛋白酶雖能選擇性作用于纖維蛋白、黏連蛋白和IV型膠原，破環板橋里的結構，但對于橋粒結構作用卻很少，因此也不能將表皮完全分散；膠原酶I能作用于結締組織中的膠原蛋白，對細胞間質產生消化作用，且對細胞本身影響不大，能使細胞保持高活力；胰蛋白酶能水解細胞間質中的蛋白質，破環細胞間的半橋粒和橋粒結構，從而使細胞分散，但其對細胞本身有損傷。但是魚類與哺乳動物的色素細胞不同，魚類色素細胞難以分離。

根據現有需要，開發一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞分離和培養方法成為亟需解決的問題。

發明內容

本發明的首要目的在于提供一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞的分離方法。

本發明第一個方面，提出了一種橘色雙冠麗魚黑色素細胞的分離方法。根據本發明的實施例，該構建方法為：將雙冠麗魚魚尾鰭、皮膚、鱗片放入胰蛋白酶中進行消化，收集細胞，再放入膠原酶中進行消化，加入不同濃度percoll試劑，收集細胞進行原代培養和傳代培養即可獲得橘色雙冠麗魚黑色素細胞。發明人發現，只用胰蛋白酶消化魚體表組織的時候，延長消化時間即過夜處理(超過6h)，魚體表組織依然消化不完全，表現為剪碎后轉入25um氣孔尼龍網過濾分裂組織，并且增加離心時間所獲得細胞液體較清澈，鏡檢里面所含細胞少量；且通過percoll試劑低速離心分離后，鏡檢所得細胞亦少量；最后進行原代培養時，鏡檢色素細胞增殖、生長慢。為了取得進一步的效果，發明人進行了優化，驚奇地發現，通過用含有牛血蛋白、膠原酶I、DNase I、以及大豆胰蛋白酶抑制劑的膠原酶溶液進行二次消化，色素細胞得到密度增大了2-3倍、原代培養時增殖、成長速度快了1倍。解決了只用胰蛋白酶溶液處理而導致表皮細胞等去除不完全影響提取到的色素細胞的細胞高密度和活力的問題。

根據本發明的實施例，包括以下步驟：

1)組織消化：將雙冠麗魚魚尾鰭、皮膚、鱗片放入胰蛋白酶消化，收集細胞，再加入膠原酶中消化，收集消化后的細胞；再依次加入55％percoll試劑、45％percoll試劑、35％percoll試劑，離心收集最上層細胞；