[發明專利]菌種ZFM54的獲取方法

在審

• 申請號: 201911342130.2
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN111286461A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 顧青;顧容鋮
• 申請（專利權）人: 顧青
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/225
• 代理公司: 寧波理文知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 33244
• 代理人: 李高峰;孟湘明

1.一菌種ZFM54的獲取方法，其特征在于，包括：

(A)從嬰兒糞便中分離乳酸菌；

(B)菌種的活化和保藏；

(C)指示菌的培養；

(D)乳酸菌初篩；

(E)產細菌素乳酸菌復篩；以及

(F)菌種鑒定。

2.根據權利要求1所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中在所述步驟(A)中，在無菌條件下，取初生嬰兒糞便用1mL滅菌生理鹽水稀釋，振蕩使其充分混勻后靜置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸鈣的MRS固體培養基平板上，倒置于37℃培養箱中厭氧培養36～48h。

3.根據權利要求1所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中在所述步驟(B)中，初步判定為乳酸菌的單菌落，接種到10mL MRS液體培養基中于37℃條件下培養24h，再以1％(v/v)的接種量進行兩次傳代培養，活化后編號保種，取700μL菌液加上300μL滅菌甘油于-80℃保藏菌株。

4.根據權利要求3所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中MRS培養基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，檸檬酸三銨3g，磷酸氫二鉀2g，無水乙酸鈉5g，七水硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫80 1mL，溶于超純水并定容至1L，調節培養基pH為6.5，121℃高壓滅菌15min。

5.根據權利要求3所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中在所述步驟(C)中，將保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌種，分別劃線于LB固體培養基平板上，在各自的最適溫度下培養至出現明顯單菌落，挑取單菌落接種于LB液體培養基中搖床振蕩培養至對數期。

6.根據權利要求5所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中LB培養基：氯化鈉10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超純水溶解并定容至1L，調節培養基pH為7，121℃高壓滅菌15min。

7.根據權利要求1所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中在所述步驟(D)中，將活化好的乳酸菌菌株按照1％比例分別接種于10mL MRS液體培養基中，在37℃條件下靜置培養24h后，4℃下8000r/min離心20min獲得上清液，發酵上清液采用牛津杯瓊脂擴散法測試抑菌活性。

8.根據權利要求7所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中牛津杯瓊脂擴散法測試方法包括步驟：(1)將滅過菌的LB半固體培養基加熱使其充分融化，輕輕振蕩混勻，并置于55℃水浴鍋中恒溫防止瓊脂凝固；(2)將滅過菌的牛津杯間隔均勻地放置在一次性培養皿上；(3)將指示菌在漩渦振蕩器中振蕩混勻，待LB半固體培養基冷卻到45℃左右后按1％(v/v)的接種量將指示菌菌懸液加入到15mL半固體培養基中，充分混勻后倒入培養皿中，輕輕旋轉平皿使其均勻覆蓋平皿表面，注意不要將培養基倒入牛津杯中；(4)待半固體培養基完全冷卻凝固后，用滅菌的鑷子將牛津杯小心拔出，制成帶圓柱形孔洞的含菌平板；(5)在每個孔洞中加入100μL待測樣品后，將平板置于4℃冰箱使樣品充分擴散4h，然后按照不同指示菌各自的最適培養條件培養12h；(6)用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄。

9.根據權利要求1所述的菌種ZFM54的獲取方法，其中在所述步驟(E)中包括步驟：排除有機酸的干擾，首先測定ZFM54發酵上清液的pH，然后用1M氫氧化鈉溶液將發酵上清液調至pH5.0，以用乳酸和醋酸調至相同pH的無菌MRS培養基為對照，對藤黃微球菌10209進行牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗，測量抑菌圈直徑大小，比較抑菌活性區別。