[發(fā)明專利]一種斜生柵藻葉綠體同源重組空載體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911341803.2
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN110747225B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔玉琳;王康;任家利;秦松
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斜生柵藻葉綠體同源重組空載體及其應(yīng)用。載體包括上下游同源臂，以及同源臂間設(shè)啟動子和終止子，啟動子和終止子之間插入與至少一個外源基因構(gòu)成的多順反子結(jié)構(gòu)的SEQ ID NO:6所示的堿基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1所示堿基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示堿基序列。采用本發(fā)明的斜生柵藻葉綠體同源重組空載體可實(shí)現(xiàn)多個外源基因在葉綠體中穩(wěn)定表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斜生柵藻葉綠體同源重組空載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

斜生柵藻 (Scenedesmus obliquus)是淡水單細(xì)胞真核綠藻，屬于綠藻門、綠液綱、綠球藻目柵藻科，通常由2或4個細(xì)胞組成定形群體。該藻細(xì)胞呈紡錘形或橢圓形，兩端尖細(xì)；群體兩外側(cè)細(xì)胞的游離面有時凹入，有時降起；細(xì)胞壁平整；細(xì)胞寬3-6 μm，長13-16μm；4個細(xì)胞組成的群體寬為12-24 μm。細(xì)胞含內(nèi)有一個核蛋白和一個周生色素體。光合作用色素主要為葉綠素a、葉綠素b、葉黃素以及類胡蘿卜素。正常悄況下，藻細(xì)胞呈草綠色，在營養(yǎng)豐富的靜水屮以似親袍子的方式進(jìn)行繁殖。

斜生柵藻應(yīng)用范圍非常廣泛。斜生柵藻廣泛分布于溫暖地區(qū)池塘、溝渠及河流中，不僅在水生生態(tài)系占有重要的地位,而且在人工環(huán)境中也極易培養(yǎng)，因此被廣泛用作輪蟲、草食性魚類、甲殼類及軟體動物的飼料餌料。由于斜生柵藻對有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的耐受性,因此被用作水質(zhì)評價的指示生物,是甲型中污帶的指示種。斜生柵藻一方面通過光合作用為細(xì)菌分解有機(jī)質(zhì)提供氧氣,同時還可以直接利用水體中的氮 等物質(zhì)進(jìn)行生長，降低水體中有機(jī)物、氮 含量，從而達(dá)到凈化水質(zhì)的效果。受能源危機(jī)的影響，斜生柵藻因油脂含量高且有良好的脂肪酸組成,富含亞麻酸和其他多不飽和脂肪酸，在生產(chǎn)生物能源方面的潛力備受關(guān)注。斜生柵藻不但可用于生產(chǎn)生物柴油,而且還有生產(chǎn)氫氣和乙醇的潛能。

利用斜生柵藻生產(chǎn)油脂等生物能源產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)C0₂減排、廢水凈化和資源能源生產(chǎn)的高度稱合，不但不與人爭糧爭地爭水；而且還能改善環(huán)境，獲得“環(huán)境增值能源”以及其它高附加值產(chǎn)品，對社會的可持續(xù)發(fā)展具有靈大意義，但目前對斜生柵藻的分子遺傳學(xué)研究還很少，為更好地調(diào)控斜生柵藻的油脂代謝和生物量積累，需從基因水平對其進(jìn)行深層次的研究。

斜生柵藻的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，目前已經(jīng)建立了細(xì)胞核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，即利用電擊轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。但是細(xì)胞核表達(dá)系統(tǒng)存在其固有的問題，如核基因組結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)定向重組、定點(diǎn)突變；外源基因表達(dá)效率低，且表達(dá)不穩(wěn)定。作為能夠進(jìn)行光合作用的真核生物，斜生柵藻具有葉綠體和線粒體兩種具有相對獨(dú)立遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器。其中葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化相較于細(xì)胞核轉(zhuǎn)化具有以下優(yōu)點(diǎn)：原核表達(dá)系統(tǒng)、葉綠體基因組定點(diǎn)轉(zhuǎn)化、無基因沉默、外源基因表達(dá)效率高且變異小等。因此開發(fā)斜生柵藻的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對于斜生柵藻的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)具有重要價值。目前尚沒有專門針對斜生柵藻的葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究，這嚴(yán)重阻礙了該藻的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種斜生柵藻葉綠體同源重組空載體及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種斜生柵藻葉綠體同源重組空載體，包括上下游同源臂，以及同源臂間設(shè)啟動子和終止子，啟動子和終止子之間插入與至少一個外源基因構(gòu)成的多順反子結(jié)構(gòu)的SEQ IDNO:6所示的堿基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1 所示堿基序列，下游同源臂含SEQID NO:2所示堿基序列。

所述同源臂間插入選擇標(biāo)記基因。

所述上游同源臂與下游同源臂間插入至少一個啟動子和終止子。

所述重組空載體依次含上游同源臂、至少一個啟動子、選擇標(biāo)記基因、與至少一個外源基因構(gòu)成多順反子結(jié)構(gòu)的SEQ ID NO:6所示的堿基序列、終止子、和下游同源臂。