[發明專利]特異性引物探針組合及其適于血液直接擴增結合熒光PCR法檢測葉酸代謝能力基因的應用

在審

• 申請號: 201911341764.6
• 申請日: 2019-12-24
• 公開（公告）號: CN111020026A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 肖磊;李剛;顏樺;郝婷
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

1.一種適用于血液直接擴增結合熒光PCR方法的特異性引物探針組合，其針對葉酸代謝能力基因，具體是MTHFR基因C677T位點；該特異性引物探針組合包括：目的基因ARMS引物、通用引物及熒光探針；所述目的基因ARMS引物分為C基因型特異性引物和T基因型特異性引物；

C基因型特異性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；

T基因型特異性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT；

通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；

熒光探針：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；

其中，HEX為熒光修飾基團，BHQ1為熒光淬滅基團；

所述血液直接擴增結合熒光PCR方法是針對抗凝全血樣本，在反應體系中加入核酸釋放劑、擴增酶、以及所述特異性引物探針組合進行熒光PCR程序得出相應基因型。

2.權利要求1所述的特異性引物探針組合在制備針對MTHFR基因C677T位點多態性檢測的試劑盒方面的用途。

3.一種針對MTHFR基因C677T位點多態性檢測的試劑盒，其特征在于，包括：權利要求1所述的特異性引物探針組合、內參基因的引物探針組合、核酸釋放劑、擴增酶和超純水，所述內參基因的引物探針組合中的熒光探針與所述特異性引物探針組合中的熒光探針采用不同的熒光修飾基團(FAM修飾)。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述內參基因的引物探針組合的序列信息如下：

上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG

下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT

熒光探針：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'。

5.一種針對MTHFR基因C677T位點多態性的血液直接擴增結合熒光PCR檢測方法，用于非疾病診斷目的，包括以下步驟：

(1)獲取待測抗凝全血樣本，并用超純水稀釋；

(2)配置兩組PCR反應體系，其中：第一組PCR反應體系包括：

677C特異性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；

677通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；

677熒光探針：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；

ACTB上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG；

ACTB下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT；

ACTB熒光探針：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'；

以及核酸釋放劑、擴增酶和超純水；

第二組PCR反應體系與第一組PCR反應體系的區別僅在于將677C特異性引物替換為：

677T特異性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT，其他均相同；

兩組PCR反應體系分別充分混勻；

(3)在兩組PCR反應體系中分別加入步驟(1)得到的抗凝全血樣本，運行實時熒光PCR擴增程序；

(4)根據兩組PCR反應體系的擴增情況判斷樣本基因型；判讀標準如下：

a)若該樣本在第一組PCR反應體系和第二組PCR反應體系中的FAM通道、HEX通道均表現出正常擴增，且兩個反應Ct的值差的絕對值<3，則該樣本為基因型為CT雜合型；

b)若該樣本在第二組PCR反應體系中的FAM通道呈現正常擴增，而在第一組PCR反應體系中的HEX通道呈現正常擴增,則表明該樣本基因型為CC純合型；

c)若該樣本在第一組PCR反應體系中的FAM通道呈現正常擴增，而在第二組PCR反應體系中的HEX通道呈現正常擴增,則表明該樣本基因型為TT純合型。

6.根據權利要求5所述的血液直接擴增結合熒光PCR檢測方法，其特征在于：步驟(3)運行實時熒光PCR擴增程序，具體如下：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共40個循環；72℃延伸1分鐘；儀器降溫到4℃。

7.權利要求1所述的特異性引物探針組合在構建針對MTHFR基因C677T位點多態性檢測的智能檢測設備方面的用途，所述智能檢測設備支持權利要求5所述的血液直接擴增結合熒光PCR檢測方法的執行。