[發明專利]一株邊緣假單胞菌及其在制備2,5-呋喃二甲酸中的應用

有效

• 申請號: 201911338634.7
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110904014B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 鄭兆娟;譚黃虹;周鳳;歐陽嘉;鄒麗花;徐茜茜
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/04;C12R1/38
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一株邊緣假單胞菌，其分類命名為邊緣假單胞菌（Pseudomonas marginalis），菌株名為19Z，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2019年11月28日，保藏編號為CCTCC NO: M 2019984。

2.權利要求1所述的邊緣假單胞菌及以邊緣假單胞菌為出發菌制備得到的重組邊緣假單胞菌在制備2,5-呋喃二甲酸中的應用；

其中，所述重組邊緣假單胞菌為對邊緣假單胞菌CCTCC NO: M 2019984進行遺傳修飾，得到重組邊緣假單胞菌；其中，所述遺傳修飾為在胞內過表達將5-羥甲基糠醛的羥甲基氧化為醛基的基因；其中，所述基因為半乳糖氧化酶突變體，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：

（1）對邊緣假單胞菌CCTCC NO: M 2019984進行遺傳修飾，得到重組邊緣假單胞菌，將由重組邊緣假單胞菌制得的種子液接種到培養基中進行培養，得到第一發酵液，分離，收集第一菌體細胞；

（2）利用步驟（1）得到的第一菌體細胞催化5-羥甲基糠醛轉化，得到氧化中間產物的轉化液；

（3）將邊緣假單胞菌CCTCC NO: M 2019984制得的種子液接種到培養基中進行培養，得到第二發酵液，分離，收集第二菌體細胞；

（4）將步驟（3）得到的第二菌體細胞與步驟（2）得到的轉化液混合，并加入CaCO₃進行催化反應，得到2,5-呋喃二甲酸。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（1）中，所述的遺傳修飾為在胞內過表達將5-羥甲基糠醛的羥甲基氧化為醛基的基因。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（1）中，所述的培養基包括0.1~10 mM的鎢酸鹽的LB培養基。

6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（1）中，按照0.5~10 v/v%的接種量將種子液接入到培養基；所述的培養為在25~40℃，100~200 r/min條件下培養至對數中期后的8~14 h；

其中，在培養至對數中期時添加終濃度為1 mM異丙基硫代半乳糖苷。

7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（2）中，所述5-羥甲基糠醛為含有5-羥甲基糠醛的緩沖溶液；所述緩沖溶液的pH值為5.0~9.0；所述的緩沖溶液中5-羥甲基糠醛的含量為10~300 mM；所述第一菌體細胞與緩沖溶液的質量體積比為3~50 g干細胞/L；反應條件為15~50℃，50~300 r/min，反應10 min~12 h。

8.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（3）中，按照0.5~10 v/v%的接種量將種子液接入到培養基；所述的培養為在25~40℃，100~200 r/min的條件下培養至對數中期后的6~12 h。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，在培養至對數中期時，添加誘導劑；其中，所述的誘導劑為5-羥甲基糠醛和糠醛中的任意一種；控制誘導劑的添加量使其濃度為0.5~6 mM。

10.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟（4）中，所述第二菌體細胞與步驟（2）得到產物的質量體積比為3~50 g干細胞/L轉化液；碳酸鈣的添加量為2~8 g/L轉化液；所述催化反應的條件為15~50℃，50~300 r/min反應10 min~12 h。