[發明專利]一種雙組分調控系統及其在制備維生素B12

有效

• 申請號: 201911335907.2
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110950938B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 張大偉;董會娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N1/21;C12P19/42;C12R1/01
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本發明公開一種雙組分調控系統的突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。在苜蓿中華根瘤菌中過表達的雙組分調控系統基因和突變基因的基因工程菌，其生產維生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有較大的應用推廣價值。

技術領域：本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種雙組分調控系統及其在制備維生素B₁₂中的應用。

背景技術：

維生素B₁₂(VB₁₂)又叫鈷胺素，屬于咕啉類化合物，是唯一含金屬元素的維生素類化合物，是B族維生素發現最晚的大分子有機化合物。根據咕啉環上方的配基(R基團)種類不同，維生素B₁₂可分為：羥基鈷胺素，脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。維生素B₁₂參與了大量的生化反應過程包括DNA的合成和調控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能力的產生。

微生物發酵法目前是生產維生素B₁₂的最廉價的方法，能夠大量生產并推廣其使用。目前，國內外針對維生素B₁₂生產菌生物合成維生素B₁₂的研究主要集中在發酵過程優化，主要涉及培養基包括碳氮源和金屬離子的優化、甜菜堿的添加、魚藤酮的添加，工藝條件包括pH 和供氧的控制等(程立芳等,不同來源的尿卟啉原III轉甲基酶在脫氮假單胞菌中的表達及其對生產維生素B₁₂的影響.工業微生物，2017，第47卷第3期)。

雙組分系統(two-component system)普遍存在于細菌中，是細胞感應各種各樣的環境刺激和做出相應反饋的重要機制。典型的雙組分系統通常包括兩個部分，組氨酸蛋白激酶(sensor kinase)和反應調節蛋白(response regulator)。其中組氨酸蛋白激酶感應不同類型的信號(環境變化)，并通過磷酸轉移反應調控反應調節蛋白的功能。通常，磷酸化后的反應調節蛋白可以做為轉錄增強子或抑制子直接結合至受其調節的基因的啟動子區域，影響這些被調節基因的表達水平，進而使細胞對外界的信號做出正確的生理反應。該系統可以調節各種各樣的細胞過程，是允許細胞的基因網絡對于不同的外界環境做出適應和維持細胞生存能力的重要機制。

目前，在產維生素B₁₂菌種中哪個雙組分系統影響維生素B₁₂的產量尚未見到報道。

發明內容：

本發明人對前期篩選出的高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，通過對其進行誘變，獲得一株產維生素B₁₂能力提高的誘變菌株。本發明作了進一步研究以發現對產維生素B₁₂能力有影響的基因。經過研究發現一種雙組分調控系統編碼基因和突變基因，其導入苜蓿中華根瘤菌中過表達，能夠提高所述菌的產維生素B₁₂的能力。該發明對于研究產維生素B₁₂菌種的基因調控有重要意義。

首先，本發明提供一種雙組分調控系統的響應調控子的突變體，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.4所示原始序列的基礎上具有下述突變：第418位氨基酸替換為A。

優選地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

其次，本發明提供如述的雙組分調控系統的響應調控子的突變體的編碼基因。

優選地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

第三方面，本發明提供雙組分調控系統編碼基因在制備維生素B₁₂中的應用。

具體地，通過含有所述編碼基因的表達載體導入苜蓿中華根瘤菌中進行過表達，所述導入的編碼基因位于質粒或染色體中。

優選地，所述苜蓿中華根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏號的菌株。