[發(fā)明專(zhuān)利]異檸檬酸裂合酶突變體、突變基因及其在制備維生素B12

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911335895.3
• 申請(qǐng)日: 2019-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111041020B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張大偉;董會(huì)娜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/88
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/74;C12P19/42;C12R1/41
• 代理公司: 天津市三利專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發(fā)明公開(kāi)一種異檸檬酸裂合酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應(yīng)用。在苜蓿中華根瘤菌中過(guò)表達(dá)的異檸檬酸裂合酶基因和突變基因的基因工程菌，其生產(chǎn)維生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有較大的應(yīng)用推廣價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到異檸檬酸裂合酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

維生素B₁₂(VB₁₂)又叫鈷胺素，屬于咕啉類(lèi)化合物，是唯一含金屬元素的維生素類(lèi)化合物，是B族維生素發(fā)現(xiàn)最晚的大分子有機(jī)化合物。根據(jù)咕啉環(huán)上方的配基(R基團(tuán))種類(lèi)不同，維生素B₁₂可分為：羥基鈷胺素，脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。維生素B₁₂參與了大量的生化反應(yīng)過(guò)程包括DNA的合成和調(diào)控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能力的產(chǎn)生。

由于維生素B₁₂分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)法人工合成需要消耗大量的人力與物力，而且合成周期長(zhǎng)。在合成過(guò)程中對(duì)操作人員的要求過(guò)高，導(dǎo)致不能大量的生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法目前是生產(chǎn)維生素B₁₂的最廉價(jià)的方法，能夠大量生產(chǎn)并推廣其使用。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)維生素B₁₂生產(chǎn)菌生物合成維生素B₁₂的研究主要集中在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，主要涉及培養(yǎng)基包括碳氮源和金屬離子的優(yōu)化、甜菜堿的添加、魚(yú)藤酮的添加，工藝條件包括pH和供氧的控制等。有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)在脫氮假單胞菌基因組上表達(dá)單拷貝的透明顫菌vgb 基因來(lái)增加細(xì)胞生產(chǎn)維生素B₁₂的能力(程立芳等,不同來(lái)源的尿卟啉原III轉(zhuǎn)甲基酶在脫氮假單胞菌中的表達(dá)及其對(duì)生產(chǎn)維生素B12的影響.工業(yè)微生物，2017，第47卷第3期)。

異檸檬酸裂合酶(Isocitrate lyase，縮寫(xiě)ICL，EC 4.1.3.1)是以一種在乙醛酸循環(huán)中將異檸檬酸切割為乙醛酸和琥珀酸的酶。其產(chǎn)物再通過(guò)蘋(píng)果酸合酶合成蘋(píng)果酸，跳過(guò)了三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中脫去二氧化碳的兩步。這一途徑廣泛存在于細(xì)菌、真菌與植物中。在催化過(guò)程中，異檸檬酸被去質(zhì)子化，羥醛裂解導(dǎo)致琥珀酸酯和乙醛酸酯的釋放。該反應(yīng)機(jī)制的功能與糖酵解中的醛縮酶類(lèi)似，在糖酵解中碳-碳鍵斷裂并生成的新的醛類(lèi)。在乙醛酸循環(huán)中，蘋(píng)果酸合酶然后催化乙醛酸和乙酰輔酶A縮合形成蘋(píng)果酸，因此循環(huán)可以繼續(xù)進(jìn)行。通過(guò)從 TCA循環(huán)轉(zhuǎn)移異檸檬酸，ICL和蘋(píng)果酸合酶在乙醛酸循環(huán)中的作用導(dǎo)致碳與2-碳化合物的凈同化。因此，盡管TCA循環(huán)不產(chǎn)生凈碳同化，但乙醛酸循環(huán)產(chǎn)生的中間體可用于合成葡萄糖 (通過(guò)糖異生)以及其他生物合成產(chǎn)物。因此使用ICL和蘋(píng)果酸合酶的生物體能夠從乙酸酯衍生的乙酰輔酶A或乙醇，脂肪酸或聚β-羥基丁酸酯的降解物中合成葡萄糖及其代謝中間體。目前尚未有異檸檬酸裂合酶基因aceA用于維生素B₁₂合成的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明人對(duì)前期篩選出的高產(chǎn)維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行誘變，獲得一株產(chǎn)維生素B₁₂能力提高的誘變菌株。本發(fā)明作了進(jìn)一步研究以發(fā)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)維生素B₁₂能力有影響的基因。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)異檸檬酸裂合酶基因aceA和突變基因?qū)胲俎Ｖ腥A根瘤菌中過(guò)表達(dá)，能夠提高所述菌的產(chǎn)維生素B₁₂的能力。

首先，本發(fā)明提供一種異檸檬酸裂合酶的突變體，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.2所示原始序列的基礎(chǔ)上具有下述突變：第195位氨基酸替換為S，或者第195位氨基酸替換為S并且第213位氨基酸替換為T(mén)。

優(yōu)選地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4或6所示。

其次，本發(fā)明提供如述的異檸檬酸裂合酶的突變體的編碼基因。

優(yōu)選地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示。