[發明專利]一種貓細小病毒重組蛋白及其單克隆抗體的制備

有效

• 申請號: 201911334829.4
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110845582B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 武妮妮;洪淑凡;陳安琪;吳瓊杉;余銘恩
• 申請（專利權）人: 杭州賢至生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/015
• 分類號: C07K14/015;C07K16/08;C12N15/13;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州仁杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 33297
• 代理人: 張俊

本發明屬于生物工程技術領域。本發明涉及一種貓細小病毒重組蛋白，該貓細小病毒重組蛋白包含貓細小病毒(FPV)抗原的兩個優勢表位，為提高該重組蛋白在原核表達系統中的產量，采用大腸桿菌偏愛密碼子將該重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，化學合成該核苷酸序列并構建重組表達載體。本發明還涉及該貓細小病毒重組蛋白單克隆抗體的制備，經過免疫、細胞融合及多輪篩選后得到雜交瘤細胞株，純化單克隆抗體并分別標記膠體金顆粒，通過正交實驗確定最佳單抗配對組合，可用于貓細小病毒感染的早期診斷。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域。具體來說，本發明涉及一種新的貓細小病毒重組蛋白，通過基因工程技術編碼合成該貓細小病毒重組蛋白的核苷酸序列，構建含有上述核苷酸序列的質粒載體，轉化有上述質粒載體的大腸桿菌菌株，表達貓細小病毒重組蛋白；使用上述重組蛋白制備單克隆抗體，并應用于貓細小病毒感染的初步診斷。

背景技術

貓細小病毒(Feline parvovirus，FPV)又稱貓泛白細胞減少癥病毒、貓傳染性腸炎病毒、貓瘟病毒，貓感染細小病毒后的臨床表現主要為高熱、嘔吐、腹瀉和腸炎，能夠導致白細胞數目嚴重減少。該病毒主要感染貓科和鼬科等多種動物，尤其以6月齡以下幼小動物的發病率和死亡率更高，是目前細小病毒屬中感染范圍最廣，致病性最強的一種病毒。

自然條件下，感染動物特別是發病動物的糞便、尿等排泄物和鼻、眼、唾液等分泌物以及嘔吐物均帶毒，可污染飼料、飲水、器具和周圍環境。當感染動物血清中存在FPV抗體時，其糞尿仍可向外界排毒6周之久。隨著貓細小病毒危害的加重，許多研究人員對其開展了實驗室診斷。主要有貓細小病毒的分離鑒定，該方法利用培養細胞來觀察細胞病變，但有些病毒增殖緩慢，不能在細胞培養物中生長，與臨床發病時間相比，排毒時間可能很短，而在樣本貯存和運輸過程中，可能喪失感染性，并且該方法需要操作者有一定的經驗，花費較高。電鏡檢查試驗敏感度較低，不能區別形態類似的不同病毒，且樣本處理量大，限制了該方法的應用。RT-PCR法檢測貓細小病毒核酸，該方法特異性和敏感性好，能快速區分病毒，適合大量樣本同時檢測，但是設備昂貴，對操作人員要求高，檢測時間較長，并且檢測費用高。

目前，免疫學方法檢測貓細小病毒由于操作簡便、結果易于判定，已成為主流方向。免疫學方法采用單克隆抗體識別檢測血液樣本中的貓細小病毒抗原，該方法特異性及靈敏度俱佳。若結合膠體金平臺，一般能在10～15分鐘內獲得準確結果，適合大批量樣本快速檢測，無特殊設備及人員要求，主人在家就可以檢測。

發明內容

設計目的：通過設計一種貓細小病毒重組蛋白并制備其單克隆抗體，從而實現貓細小病毒的特異性識別檢測，既增強了檢測靈敏度，又不會導致檢測結果失真。

設計方案：為了實現上述設計目的。本申請：(1)以貓細小病毒衣殼蛋白為靶抗原，分析并選擇該抗原的兩個特異性優勢表位，序列比對結果顯示所選擇的兩個抗原表位與其它蛋白序列無明顯同源性。(2)為了促進所選擇優勢抗原表位對Balb/c小鼠免疫系統的刺激，增強免疫效果，將所選擇的兩個優勢抗原表位序列通過柔性片段(連續四個甘氨酸)串聯后四次重復，形成貓細小病毒重組蛋白氨基酸序列。(3)采用大腸桿菌偏愛密碼子，將貓細小病毒重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，以利于該重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達。(4)化學合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過酶切連接，將合成得到的核苷酸片段插入原核表達載體pET-28a(+)，構建重組蛋白表達載體。(5)貓細小病毒重組蛋白表達載體轉化大腸桿菌ER2566感受態細胞，利用卡那青霉素抗性篩選培養基篩選得到重組蛋白表達菌株。(6)重組蛋白表達菌株大規模培養后，超聲破菌并低溫離心，取溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純化的貓細小病毒重組蛋白。(7)純化的貓細小病毒重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經多輪篩選并最終得到雜交瘤細胞株。(8)將雜交瘤細胞株分別制備Balb/c小鼠腹水，使用正辛酸-硫酸銨沉淀法及Protein A親和層析分兩步純化單克隆抗體，并分別標記膠體金顆粒。(9)正交實驗篩選顯示3A6單抗包被與7B9膠體金標記單抗配對是檢測貓細小病毒感染的最佳組合。