[發明專利]檢測RyR-Ab的電化學發光試劑盒及其制法

在審

• 申請號: 201911333627.8
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN111007261A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 卜梅杰;泮鋒綱;丁俊杰;施啟堯
• 申請（專利權）人: 江蘇三聯生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N27/26;G01N21/76
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本發明涉及一種新型的從血液樣本中檢測抗蘭尼堿受體抗體（RyR）的電化學發光試劑盒及其制備方法。制備的試劑盒包括：包被鏈霉親和素的磁珠微粒工作液，生物素標記的RyR抗原工作液，三聯吡啶釕標記的抗人IgG抗體工作液，RyR?Ab的校準品和/或質控品工作液，含三丙胺的電化學發光底物液，以及清洗液。所制備試劑盒的發光體系為電化學發光，利用鏈霉親和素?生物素生物反應信號放大系統，檢測速度快、靈敏度高、線性范圍寬、檢測結果重復性好，能夠實現血液中RyR?Ab的準確定量檢測。

技術領域

本發明涉及一種檢測RyR-Ab的電化學發光試劑盒及用法，屬于免疫分析技術領域。

背景技術

自身免疫性疾病(以下簡稱“自免”)是免疫系統對自身機體的成份發生免疫反應，造成損害而引發疾病。正常情況下，免疫系統只對侵入機體的外來物，如細菌、病毒、寄生蟲以及移植物等產生反應，消滅或排斥這些異物。在某些因素影響下，機體的組織成份或免疫系統本身出現了某些異常，致使免疫系統誤將自身成份當作外來物并對其進行攻擊。這時候免疫系統會產生針對機體自身一些成份的抗體及活性淋巴細胞，損害破壞自身組織臟器，導致疾病。若不及時有效地加以控制，其后果十分嚴重：免疫系統的攻擊會影響人體器官，且通常會終身對其進行攻擊；有時還可能同時對身體眾多部位造成損傷。早期篩查、診斷對管理和治療自免來說非常重要，在早期階段發現可避免或延遲目標器官或組織發生無法補救的損傷。

重癥肌無力(MG)是由自身抗體引起的、細胞免疫依賴的、補體參與的主要累及神經肌肉接頭突觸后膜，引起神經肌肉接頭傳遞障礙，出現骨骼肌收縮無力的獲得性自身免疫性疾病。MG人群發病率為(32～64)/10萬，我國目前約有60萬MG患者[1]。MG在各個年齡階段均可發病。在40歲之前，女性發病率高于男性；40～50歲男女發病率相當；50歲之后，男性發病率略高于女性。其主要臨床表現為骨骼肌無力、易疲勞，活動后加重，休息和應用膽堿酯酶抑制劑后癥狀明顯緩解、減輕。其特點是發病率高、致殘率高、預后差、易復發，已經嚴重威脅到人類的生活和健康，得到了醫療、科研工作者的廣泛關注。

MG是典型的抗體介導的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突觸后膜的乙酰膽堿受體 (AChR)，乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)與NMJ上的乙酰膽堿受體(AChR)相結合，導致AChR數量減少和功能的喪失，AchR-Ab陽性是MG的主要免疫學致病機制，AchR-Ab在MG 中的陽性率為80％以上。但AchR-Ab并非存在于所有的MG患者中，且其與病情嚴重程度、是否合并胸腺瘤和發病年齡無相關性。近年研究發現，部分MG患者血清中存在針對骨骼肌和心肌橫紋肌組分的抗體，包括肌球蛋白、肌動蛋白、細絲蛋白等，這些抗體稱為橫紋肌抗體。在約95％重癥肌無力伴胸腺瘤(MGT)及50％晚發型MG患者血清中存在2種橫紋肌抗體，即肌聯蛋白(titin)和蘭尼堿受體(RyR)抗體[2]。其中Titin-Ab對診斷MGT的敏感性高，而RyR-Ab 對診斷MGT的特異性高[3]。

蘭尼堿受體(RyR)是肌漿網中的鈣離子釋放通道，連接肌纖維膜的T管和肌質網。T管的壓力感受器二氫吡啶受體傳遞神經沖動至RyR，導致通道開放。肌漿網中的鈣離子順濃度差釋放到胞質中，胞質中的鈣離子與肌鈣蛋白(troponin C,TnC)結合觸發肌肉收縮。RyR受體有2種亞型：心肌RyR 2受體和骨骼肌RyR 1受體，MG患者血清中的RyR抗體可與這2種受體產生交叉反應。RyR-Ab可能通過干擾RyR和二氫吡啶受體的作用，從而抑制RyR通道的開放和鈣離子的釋放，使骨骼肌不能有效的收縮，導致肌無力的發生[4]。RyR-Ab在MG患者中的陽性率為13％～38％，在MGT中的陽性率為70％～80％，并且與MG患者的病情嚴重程度相關。 RyR-Ab對MGT的靈敏度為70％，特異度為95％[5]。目前RyR-Ab的檢測方法主要包括ELISA 檢測和免疫印跡法(Western blotting)檢測[6]。這兩種方法都存在重現性不高，結果不夠準確，操作不便等缺陷。目前隨著免疫檢測技術的發展，磁珠法化學發光技術的優勢愈發明顯，特別是磁珠法電化學發光技術的準確性，靈敏度，重現性等性能明顯好于ELISA等方法。目前尚無電化學發光技術用于RyR-Ab的檢測。