[發(fā)明專利]一種蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及其在莽草酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911331142.5
• 申請(qǐng)日: 2019-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110904140B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝之奎;李建宋;王繼棟;楊仲毅;游學(xué)秋;宋云平;張超;詹小遠(yuǎn);高影
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12P7/42;C12N1/21;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，在大腸桿菌中，該系統(tǒng)通過(guò)組合使用生長(zhǎng)期關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子P_GPP和C末端降解標(biāo)簽SsrA作用于靶蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)，其中，所述靶蛋白受生長(zhǎng)期關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子P_GPP控制，且含有C末端降解標(biāo)簽SsrA；所述生長(zhǎng)期關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子P_GPP包括P_rpsL、P_rrnA、P_rpsT、P_rrnC或P_rpsA；所述C末端降解標(biāo)簽SsrA包括LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD；所述P_rpsL、P_rrnA、P_rpsT、P_rrnC或P_rpsA的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.5所示；所述LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示。

2.如權(quán)利要求1所述的調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述靶蛋白為莽草酸激酶I或綠色熒光蛋白GFP。

3.如權(quán)利要求2所述的調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，所述靶蛋白為莽草酸激酶I。

4.一種基因工程菌，其特征在于，以大腸桿菌為宿主菌，引入權(quán)利要求1所述動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)控制靶蛋白的表達(dá)。

5.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌敲除了莽草酸激酶I基因aroK和莽草酸激酶II基因aroL，并將菌株的PTS系統(tǒng)替換為葡萄糖易化蛋白基因Zmglf。

6.如權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為敲除了莽草酸激酶I基因aroK和莽草酸激酶II基因aroL并將PTS系統(tǒng)替換為來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡萄糖易化蛋白基因Zmglf的E. coli MG1655。

7.一種構(gòu)建如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的基因工程菌的方法，其特征在于，具體步驟包括：（1）構(gòu)建基因工程改造質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為PJ01-GABE和p15A-P_GPP-aroK-SsrA；（2）將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；（3）混合培養(yǎng)得到接合轉(zhuǎn)移的莽草酸生產(chǎn)菌，其中，

所述步驟（1）中質(zhì)粒PJ01-GABE的構(gòu)建方法為：以大腸桿菌MG1655基因組為模板，分別擴(kuò)增獲得含有B0034RBS的aroB^opt、aroE、aroG^fbr、tktA片段，將aroB^opt、aroE兩個(gè)片段采用多片段一步同源重組的方式，插入至pJ01的表達(dá)框中，獲得pJ01-BE質(zhì)粒，將aroG^fbr、tktA兩個(gè)片段采用多片段一步同源重組的方式，插入至質(zhì)粒pJ01的表達(dá)框中，獲得pJ01-GA質(zhì)粒，使用BamHI和XbaI限制性內(nèi)切酶切割pJ01-GA質(zhì)粒，回收載體，使用BgIII和XbaI限制性內(nèi)切酶切割pJ01-BE質(zhì)粒，回收片段；采用同尾酶連接的方式分別組裝pJ01-GA和pJ01-BE質(zhì)粒，最終獲得質(zhì)粒PJ01-GABE；

所述步驟（1）中質(zhì)粒p15A-P_GPP-aroK-SsrA的構(gòu)建方法為：合成生長(zhǎng)期啟動(dòng)子P_GPP序列，替換載體pTet-1中原有的P_tet啟動(dòng)子，獲得的質(zhì)粒命名為p15A-P_GPP，以大腸桿菌MG1655基因組為模板，擴(kuò)增基因aroK，并在其3’端融合不同的降解標(biāo)簽SsrA,將融合有不同降解標(biāo)簽的aroK-SsrA插入至p15A-P_GPP中獲得質(zhì)粒p15A-P_GPP-aroK-SsrA。

8.一種生產(chǎn)莽草酸的方法，其特征在于，以權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的基因工程菌為發(fā)酵微生物，以葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵。