[發(fā)明專(zhuān)利]基于暗場(chǎng)散射成像的PARP-1單粒子檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911325620.1
• 申請(qǐng)日: 2019-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111024624B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 衛(wèi)偉;張多多;劉松琴
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/25
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/25
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

1.基于暗場(chǎng)散射成像的PARP-1單粒子檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

1 ） Au₅₀的制備；

2 ） Au₅₀-dsDNA的制備；

3）Au₈的制備；

4）在Au₅₀-dsDNA中加入NAD⁺和含有PARP-1的待測(cè)溶液中擴(kuò)增，然后取樣滴加在氨基功能化的玻璃片上，靜電吸附后，洗去未結(jié)合的探針，加入過(guò)量的Au₈，靜電吸附后，洗去未結(jié)合的Au₈，在暗場(chǎng)顯微鏡下采集圖像和利用光譜儀采集單粒子的光譜曲線(xiàn)，根據(jù)位移的變化來(lái)確定PARP-1的濃度；

所述Au₅₀-dsDNA的合成步驟如下：

A1）首先，將BSPP加入到Au₅₀溶液中，在室溫?cái)嚢柘路跤^(guò)夜，然后混合物離心后，沉淀復(fù)溶于超純水，向溶液中加入少量BSPP，搖晃均勻后獲得Au₅₀-BSPP；

A2）其次，將Au₅₀-BSPP與s-DNA混合，然后在室溫下輕輕攪拌后，每隔3 h加NaCl，使其最終鹽濃度達(dá)到150 mM得到Au₅₀溶液；

A3）將SH-PEG-800加入上述Au₅₀溶液中并孵育1h，然后加入c-DNA輕輕搖晃2 h，最后進(jìn)行離心得到Au₅₀-dsDNA；所述s-DNA和c-DNA序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于暗場(chǎng)散射成像的PARP-1單粒子檢測(cè)方法，其特征在于，所述Au₅₀的合成步驟如下：

S1）通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為13nm的金納米粒子：將檸檬酸三鈉溶液快速加入攪拌中且沸騰的氯金酸溶液，混合溶液顏色依次從黃色到無(wú)色，再變?yōu)楹谏⒆仙罱K為酒紅色，繼續(xù)攪拌并保持沸騰，待自然冷卻至室溫后，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

S2）通過(guò)種子生長(zhǎng)法制備粒徑為50nm的金納米粒子：將超純水、新鮮制備的Au₁₃、NH₂OH·HCl溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液依次加入圓底燒瓶中，然后室溫下將氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并劇烈攪拌，停止攪拌后室溫放置，最后所制得的Au₅₀于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于暗場(chǎng)散射成像的PARP-1單粒子檢測(cè)方法，其特征在于，所述Au₈的合成步驟如下：

B1）將氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化銨在室溫下連續(xù)攪拌；

B2）滴入硼氫化鈉，溶液顏色由藏紅花黃色變?yōu)槌燃t色，表明成功制備了Au₈。

4.一種免標(biāo)記的用于鑒定癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括Au₅₀-dsDNA、NAD⁺和Au₈。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免標(biāo)記的用于鑒定癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括氨基功能化的玻璃片。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免標(biāo)記的用于鑒定癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述NAD⁺濃度為1-10μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求4~6任一項(xiàng)所述的免標(biāo)記的用于鑒定癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述癌細(xì)胞為卵巢癌A2780細(xì)胞或人乳腺癌MCF-7細(xì)胞。