[發明專利]一種液相色譜串聯質譜定量檢測意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法

有效

• 申請號: 201911321890.5
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN110736802B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 楊術鵬;李熠;叢曉蕾;周金慧;張金震;金鑰;黃京平;楊宇輝;袁媛;趙文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

1.一種液相色譜串聯質譜定量檢測意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括：通過液相色譜串聯質譜法檢測待測蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:

特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，

特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性;

在檢測之前用檢測試劑盒處理所述待測蜂蜜，所述檢測試劑盒由以下成分組成:

（1）提取緩沖液0.01 m/L PBS，pH 7.4；

（2）胰蛋白酶20 ng/μL，溶劑為40mM碳酸氫氨；

（3）特征肽段1、2的標準品。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：

A、配制含有固定濃度的穩定同位素內標肽段的不同濃度的特征肽段標準品溶液，進入液相色譜串聯質譜檢測并繪制標準曲線；

B、提取所述待測蜂蜜中的蛋白質，用胰蛋白酶進行酶切，對酶解產物除鹽后作為待測樣本；

C、向所述待測樣本中添加所述穩定同位素內標肽段使其濃度與步驟A中的濃度相同，采用步驟A中相同方法進行液相色譜串聯質譜檢測；

D、對照步驟A所得標準曲線，獲得所述待測樣本中特征肽段的濃度，從而實現對α-葡萄糖苷酶的定量檢測。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟A和C中采用三重四級桿或Q Exactiveplus液質聯用儀進行液相色譜串聯質譜檢測。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，以SISNNEQVK為定量特征肽段，其在質譜中所產生的檢測信號的母離子具有509.76182的質荷比，包含質荷比為713.36824、818.40027的子離子，檢測允許偏差在10 ppm以內。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述穩定同位素內標肽段為：SISNNEQVK*，其中，K*表示賴氨酸中的碳置換為¹³C，氮置換為¹⁵N；

所述穩定同位素內標肽段在質譜中產生的檢測信號的母離子為m/z: 513.76642，包含質荷比為1088.52023、858.45036的子離子。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟A得到的標準曲線為Y=0.00982X-0.000624，R²=0.9983，其中，Y為特征肽段/穩定同位素內標肽段的峰面積比，X為特征肽段的濃度；檢測范圍為10-1000 ng/mL，最低檢出限為5 ng/mL。