[發(fā)明專利]一種靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9載體及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2019-12-19
• 公開（公告）號: CN110904111A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉小豐;江東;趙曉春;朱世平;申晚霞;余歆
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明提供了靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9載體及其應(yīng)用，涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域；所述sgRNA序列包括：FcMYC2sgRNA?1或FcMYC2sgRNA?2；利用所述sgRNA序列構(gòu)建CRISPR/Cas9載體；最后將含有所述CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化柑橘上胚軸，獲得FcMYC2基因被編輯、蛋白功能敲除的植株。本發(fā)明具有sgRNA靶向性好、對FcMYC2基因切割效率高、且能在甜橙、金柑等柑橘類型中獲得純合編輯的植株，從而為進(jìn)一步研究調(diào)控柑橘精油合成機(jī)制提供強(qiáng)有力的工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

FcMYC2(Fortunella crassifolia Swing.MYC2transcription factor)是MYC2型bHLH轉(zhuǎn)錄因子，正調(diào)控柑橘精油的主要成分—單萜和倍半萜的合成。該基因是茉莉酸響應(yīng)途徑關(guān)鍵基因，位于柑橘5號染色體上，在柑橘中無其它同源基因，具有高度的特異性。

FcMYC2蛋白是bHLH超家族的成員，其N端的MYC結(jié)構(gòu)域包括7個螺旋和6個折疊，能與其它的MYC2、MYC3和MYC4蛋白形成多蛋白聚合體，在JA信號傳導(dǎo)中行使與其它響應(yīng)蛋白結(jié)合的功能。C端的HLH結(jié)構(gòu)域包括兩個螺旋和一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，第一個螺旋的第6位的谷氨酸(Glu，E)是與靶基因啟動子區(qū)域的G-box結(jié)合的特異氨基酸位點(diǎn)。兩個MYC型的HLH結(jié)構(gòu)域形成類似“剪刀”似的交叉結(jié)構(gòu)，共同作用靶基因啟動的G-box序列上，調(diào)控靶基因的表達(dá)。

FcMYC2是一個調(diào)控柑橘柑橘精油合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究表明，下調(diào)FcMYC2的表達(dá)水平能顯著降低柑橘中單萜和倍半萜的合成，同時對類黃酮、檸檬苦素等次生代謝產(chǎn)物的合成造成影響。目前并沒有一種方法，可簡單快速且高效率的敲除柑橘中的FcMYC2基因。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列、CRISPR/Cas9載體及其應(yīng)用，可直接獲得敲除FcMYC2基因的柑橘材料，為研究柑橘精油合成調(diào)控機(jī)制提供強(qiáng)有力的工具。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種靶向敲除FcMYC2基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列包括：FcMYC2sgRNA-1或FcMYC2sgRNA-2；

所述FcMYC2sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述FcMYC2sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述FcMYC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。

本發(fā)明還提供了一種靶向敲除FcMYC2基因的CRISPR/Cas9載體，所述CRISPR/Cas9載體中含有所述sgRNA序列。

本發(fā)明還提供了所述CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將所述sgRNA序列設(shè)計為寡核苷酸序列；所述寡核苷酸序列包括FcMYC2sgRNA-1Forward oligo和FcMYC2sgRNA-1Reverse oligo，或FcMYC2sgRNA-2Forward oligo和FcMYC2sgRNA-2Reverseoligo；所述FcMYC2sgRNA-1Forward oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述FcMYC2sgRNA-1Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述FcMYC2sgRNA-2Forward oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述FcMYC2sgRNA-2Reverse oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(2)將所述寡核苷酸序列退火后連接入線性化的pPIC.5載體中，得載體pPIC.5::FcMYC2sgRNA；