[發明專利]一種用于RNA恒溫擴增檢測牛支原體的引物和探針、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201911315618.6
• 申請日: 2019-12-19
• 公開（公告）號: CN110923346A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 劉喜富;烏日琴;張鑾
• 申請（專利權）人: 張家口健垣科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12Q1/6844;C12R1/35
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 王澤云

本發明公開了一種用于RNA恒溫擴增檢測牛支原體的引物和探針、試劑盒及檢測方法。本發明特異性檢測引物和探針以及含有該檢測引物和探針的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過RNA恒溫擴增的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)、快速的特點，對儀器要求低，操作過程簡單，適合食品企業和基層檢測機構自檢使用，適用于現場檢測，尤其適用于牛乳快速檢測和保障奶牛安全。

技術領域

本發明涉及致病菌微生物檢測技術領域，具體涉及一種基于RNA恒溫擴增檢測牛支原體快速檢測技術，特別涉及檢測牛支原體的特異性檢測引物和探針、試劑盒及檢測方法。

背景技術

牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis，MB)，屬于支原體屬，近些年來，由于乳液的蓬勃發展，帶動大規模養牛業迅速發展，而隨之牛支原體這種對養牛業造成巨大威脅的致病支原體引起人們的廣泛關注，可以使牛產生牛肺炎、乳腺炎、關節炎和生殖道炎癥等疾病，嚴重的會使牛流產與不孕，尤其引起的牛肺疫更是一種烈性接觸傳染病，雖然我國經認證徹底消滅此病，但對于全球來說其危害依舊令養牛業不可忽視，給養牛業帶來了巨大的經濟損失。因此，快速檢測牛乳中的牛支原體，不僅能夠及時有效地預防治療相關病牛減少損失，同時也是保障養牛業蓬勃發展的必要手段。

近年來，食源性致病菌的快速檢測和鑒定方法發展較為迅速，以免疫學為基礎的ELISA技術、免疫磁珠技術、全自動免疫酶標檢測系列、免疫膠體金技術等，以分子生物學為基礎的RNA指紋圖譜技術、實時熒光PCR技術、基因芯片技術等，以紙片法為代表的細菌代謝為基礎的酶觸反應技術等，這些快速檢測方法大大縮短了致病菌檢驗的時間，提高了檢驗效率，但也存在一些問題難以解決。國標培養法檢測牛支原體需要4～7天，行標實時熒光PCR法需要2～5天，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(SAT)檢測牛支原體需要6小時，基于核酸序列的擴增技術(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)和轉錄介導的擴增技術(Transcription Mediated Amplification，TMA)暫無相關牛支原體RNA檢測試劑盒。

傳統牛支原體檢測方法由于菌濃度較低且培養條件要求較高，耗費時間長、檢驗效率低，從而導致不能及時監控牛支原體，不能實現現場檢測。

發明內容

針對現有技術中的上述缺點，本發明提供一種用于RNA恒溫擴增檢測牛支原體的引物和探針、試劑盒及檢測方法，實現對牛支原體的現場快速、準確的檢測。根據本發明的方法，檢測僅僅需要大約150min。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于RNA恒溫擴增檢測牛支原體的引物和探針，所述引物包括：上游引物MBnT7包含：CTGACCTTCGGGTAAAGC，或TGGTTTGTCGCGTTGTTC，或其同源序列中的至少10個核苷酸序列；下游引物MB T7包含：T7啟動子序列和靶標引物序列；其中所述標靶引物序列包含CCACACCGCT AGAGC，或ACCAGGAATTCCAGT，或其同源序列中的至少8個核苷酸序列；其中所述T7啟動子序列包含AATTTAATAC AGCTCACTAT AGGGAGA，或其同源序列中的至少10個核苷酸序列；其中所述探針具有環和自身互補的莖的發夾結構。

根據本發明的某些實施方式，所述探針的兩端分別共價標記有熒光基團和淬滅基團，優選所述熒光基團包含FAM、HEX或VIC，所述淬滅基團包含DABCYL。

根據本發明的某些實施方式，所述探針序列包含CUGCGGGACCCAGGGAUGCAUGUCGCAG，或CTGCG AGCGTG CGGGCGATAC GGG CAG CGCAG，或其同源序列中的至少10個核苷酸。

根據本發明的某些實施方式，所述同源序列指的是與所述序列至少70％相同的核苷酸序列。