[發(fā)明專利]一種高效克隆植物性狀相關突變基因的方法

有效

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• 申請日: 2019-12-18
• 公開（公告）號: CN110993027B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設計）人: 趙潔;余禮;聶延伸;焦進霞
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G16B25/00
• 分類號: G16B25/00;G16B30/10
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

1.一種高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)近親雜交父母本的選擇及作圖群體的構建；

(2)對作圖群體進行表型遺傳分析并統(tǒng)計遺傳分離比，確定性狀由單基因遺傳控制；

(3)構建父本DNA Pool、母本DNA Pool和作圖群體DNA Pool，根據(jù)已有的分子標記信息，以父本DNA Pool、母本DNA Pool、作圖群體DNA Pool為對象，分析分子標記的有效性與分離情況；計算作圖群體中分子標記的配子頻率，分析分子標記與突變基因的連鎖情況，確定突變基因在染色體上存在的位置，進一步對該位置附近的其他分子標記進行PCR擴增和分析，確定突變位點的大致區(qū)域；

(4)選取父本DNA Pool、母本DNA Pool和作圖群體DNA Pools中的三個或兩個DNAPools進行重測序，分析不同DNA Pool之間的SNP和In-Del標記，檢測同一個標記在不同DNAPool之間的頻率差值和分布，結合步驟(3)所得突變位點的大致區(qū)域結果以及SNP和In-Del標記在該區(qū)域的頻率差值分布和連鎖情況，進一步縮小突變位點所在區(qū)間；所述選取兩個DNA Pools重測序時，其中一個DNA Pools為作圖群體DNA Pools，另一個DNA Pool為父本DNA Pool或母本DNA Pool；

(5)根據(jù)重測序結果對區(qū)間內的SNP和In-Del標記進行PCR驗證，利用位點特異性PCR、酶切多態(tài)性PCR和測序技術確定這些位點在群體中的連鎖情況，確定最終在突變位點兩端的標記，分析這兩個標記中間的序列，定位突變位點并克隆。

2.根據(jù)權利要求1所述的高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，步驟(1)中所述近親雜交為亞種內雜交。

3.根據(jù)權利要求1所述的高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，所述作圖群體選用F2群體、近等基因系群體、或重組自交系群體。

4.根據(jù)權利要求1所述的高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，步驟(2)中所述父本DNA Pool的構建過程：父本取不低于十株植株的基因組等量混合形成父本DNA Pool；所述母本DNA Pool的構建過程：母本取不低于十株植株的基因組等量混合形成母本DNA Pool。

5.根據(jù)權利要求1所述的高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，步驟(2)所述作圖群體DNA Pool的構建過程：取作圖群體所有植株的基因組等量混合形成群體DNA Pool。

6.根據(jù)權利要求1所述的高效克隆植物性狀相關突變基因的方法，其特征在于，步驟(4)所述重測序分析不同DNA Pool之間的SNP和In-Del標記的頻率和分布，限定每個位點標記的支持reads數(shù)不低于10，以確保克隆效率。