[發明專利]一種提高產溶劑梭菌液體發酵細胞密度的方法

有效

• 申請號: 201911311861.0
• 申請日: 2019-12-18
• 公開（公告）號: CN111088267B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 應漢杰;柳東;吳昕洋;王振宇;陳勇;劉慶國;牛歡青
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N1/21;C12P7/16;C12P7/06;C12P7/28;C12R1/145
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

一種提高產溶劑梭菌液體發酵細胞密度的方法，其是通過抑制所述產溶劑梭菌中CA_C2730基因的表達來實現。與現有技術相比，本發明具有如下優勢：本發明提供了一種簡單，直接提高產丁醇梭菌液體發酵細胞密度的方法，通過此方法得到的工程菌株在發酵過程中，當以葡糖糖為碳源，在100mL厭氧瓶中發酵時，菌體生長速度加快，丙酮丁醇梭菌細胞密度提高約50％，丁醇產量提高約30％～50％。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高產丁醇梭菌液體發酵細胞密度的方法。

背景技術

生物丁醇是一種重要的化工原料以及具有潛力的燃料。目前研究較為廣泛的產丁醇梭菌，分別為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，在厭氧條件下發酵生產丁醇，同時也伴隨其他產物丙酮和乙醇的生產，故丁醇發酵也稱為ABE發酵。近年來，梭菌分子水平的操作手段日益發展成熟，在基因層面上對其進行改造的手段也逐漸豐富起來，一些全局性的轉錄組學，蛋白組學測定也使梭菌生產丁醇過程中的代謝途徑更加清楚。

為了提高丁醇產量，目前的研究方向主要包括發酵原料的選擇、過程工程代謝調控、遺傳改造與代謝工程。在原料的選擇上，采用價格低廉的原料，如淀粉等作為發酵底物，但是發酵效率偏低，對這些原料的預處理與優化發酵條件的研究就顯得很重要，因此多種其他糖類發酵原料也被提出如高粱秸稈、木質纖維素等也被用作ABE發酵的碳源，取得不錯的效果。在發酵過程中利用外源添加來調控細胞代謝水平，例如外源添加乙酸或者丁酸能夠抑制丙酮丁醇梭菌的產酸代謝，誘導丁醇代謝，在利用木質纖維素作為發酵原料時，培養基中外源添加甘油和別嘌呤醇能夠在木質纖維素降解產生的高濃度糠醛脅迫條件下，促進菌體生產以及糠醛脫毒效率，同時提高溶劑代謝。在目前的條件下，低生產率、丁醇產物抑制等發酵中存在的問題，還需要通過誘變育種和基因工程等技術來解決，把生物合成代謝途徑朝著目的方向引導，獲得所需要的高產菌株，利用關鍵基因過表達和基因敲除技術對菌株進行遺傳改造。例如丙酮丁醇梭菌solR敲除突變菌能更加高效利用葡萄糖，產生較高濃度的溶劑。

在細菌中，組氨酸激酶在信號傳導中發揮許多功能，組氨酸激酶與它的應答調節蛋白形成雙組分信號傳導系統，在外界條件的刺激下，將信號傳導至下游，從而調控目的基因的表達。目前生物丁醇存在發酵周期長，產量低等情況，基于以上問題與現狀，我們發明一種提高產丁醇梭菌液體發酵細胞密度的方法來縮短發酵周期并提高生物丁醇的產量。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種提高產溶劑梭菌液體發酵細胞密度的方法，在液體發酵過程中細胞密度提高，發酵能力上升。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種提高產溶劑梭菌液體發酵細胞密度的方法，其是通過抑制或降低所述產溶劑梭菌中CA_C2730基因的表達來實現，即降低組氨酸蛋白激酶的酶活。

其中，所述CA_C2730基因，即組氨酸蛋白激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，CA_C2730基因編碼一種組氨酸蛋白激酶，屬于經典的雙組分信號傳導系統中的一部分，能特異地應對分子信號的刺激，并將信號識別轉化成基因激活或者是其他一些細胞反應。

其中，所述的抑制產溶劑梭菌中CA_C2730基因的表達通過在其基因內部插入一段DNA片段或刪除一段DNA片段實現。

優選地，通過ClosTron二型內含子插入失活技術實現。

其中，所述的產溶劑梭菌包括Clostridium acetobutylicum，Clostridiumautoethanogenum，Clostridium ljungdahlii，Clostridium carboxidivorans，Clostridium saccharobutylicum。

優選地，所述的產溶劑梭菌為Clostridium acetobutylicum。