[發明專利]利用堿基錯配的阻滯物對目標突變進行富集和檢測的方法

有效

• 申請號: 201911311237.0
• 申請日: 2019-12-18
• 公開（公告）號: CN111118119B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發明（設計）人: 濮悅;王倩雯;王濤
• 申請（專利權）人: 杭州瑞普基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

1.一種對目標區域基因突變進行富集的方法，其特征在于，包括：

(1)將含有待檢測目標區域的核酸樣本和第一引物、第二引物、阻滯擴增序列混合，進行第一PCR擴增，以便獲得第一擴增產物；

(2)基于所述第一擴增產物，利用所述第一引物和第三引物進行第二PCR擴增，以便獲得第二擴增產物；

其中，所述阻滯擴增序列的3’末端含有阻滯基團，所述阻滯擴增序列和所述第一引物含有部分重疊序列，

所述待檢測目標區域位于所述阻滯擴增序列與所述核酸樣本的匹配區域內，所述第一引物的3’末端位于所述待檢測目標區域的上游，

所述阻滯擴增序列與所述核酸樣本之間存在至少一個堿基不匹配位點，所述至少一個堿基不匹配位點不同于所述待檢測目標區域位點；

所述目標區域為EGFR?G719S突變，所述第一引物為SEQ?ID?NO:1，所述第二引物為SEQID?NO:2，所述阻滯擴增序列為SEQ?ID?NO:3，所述第三引物為SEQ?ID?NO:4。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列與所述核酸樣本之間存在2～5個堿基不匹配位點；

任選地，所述至少一個堿基不匹配位點的堿基類型為由C/G堿基突變為A/T堿基。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列與所述核酸樣本之間存在2～3個堿基不匹配位點。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列的Tm值高于所述第一引物的Tm值。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列的Tm值為60攝氏度～70攝氏度，所述第一引物的Tm值為55攝氏度～60攝氏度。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列的Tm值為60攝氏度。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列去除所述部分重疊序列后序列的Tm值高于所述第一引物去除所述部分重疊序列后序列的Tm值。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯基團包括選自磷酸基團、間臂C3、間臂C5、倒置A、倒置G、倒置C、倒置T或者與所述待檢測目標區域不匹配的核酸序列中的至少一種。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻滯擴增序列的堿基長度為10bp～40bp，所述第一引物的堿基長度為15bp～30bp，所述部分重疊序列的堿基長度為3～20bp。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待檢測目標區域基因突變頻率在1％以下，所述第二擴增產物中待檢測目標區域基因突變頻率達到50％以上；

任選地，所述第二擴增產物的豐度大于10％，指示所述待檢測目標區域存在突變；

所述第二擴增產物的豐度不超過10％，指示所述待檢測目標區域不存在突變。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸樣本為循環腫瘤DNA；

任選地，所述基因突變包括選自堿基置換突變、移碼突變、堿基缺失突變和堿基插入突變。

12.一種對目標區域基因突變進行檢測的方法，所述方法用于非疾病診斷目的，其特征在于，包括：

基于權利要求1～11中任一項所述的方法對目標區域基因突變進行富集，以便獲得富集產物；

將所述富集產物進行建庫、測序，基于所述測序結果，確定所述目標區域的基因突變；

任選地，所述測序為高通量測序或者一代測序。