[發明專利]一種調節釀酒酵母細胞膜磷脂抵御鹽脅迫的方法

在審

• 申請號: 201911302597.4
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN110951635A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 劉立明;殷楠楠;陳修來;劉佳;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/54;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種調節釀酒酵母細胞膜磷脂抵御鹽脅迫的方法，屬于生物工程技術領域。通過模塊化組裝CDS1和CHO1，構建出耐鹽的工程菌株，使得酵母菌株抗鹽脅迫能力增加。結果表明，釀酒酵母模塊化組裝CDS1和CHO1基因，與出發菌株相比，在鹽脅迫條件下模塊化組裝菌株生物量提高14.2％，存活率增加39.2％，半抑制濃度提高了17.82％，細胞膜完整性提高了51.34％。

技術領域

本發明涉及一種調節釀酒酵母細胞膜磷脂抵御鹽脅迫的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

微生物在發酵和生長過程中容易受到各種環境的干擾，包括外源環境和內源環境。而微生物細胞工廠則提供了一種經濟和環保的方式來生產高價值的化學品，包括生物燃料、大宗化學品和可再生原料制藥。微生物細胞工廠的效率取決于它們的生產性能、生長狀態和抗脅迫能力。釀酒酵母作為工業模式菌株，細胞工廠的建立使得其被廣泛應用于生產酒精、有機酸、蛋白質等。然而，不利的環境因素往往造成釀酒酵母難以維持高強度的發酵生產。

為了增加工業微生物對環境脅迫的耐受能力，一系列的應對策略已經被開發，包括適應性進化、誘變育種、轉運蛋白工程等。這些耐受策略雖然能夠提高微生物的環境耐受能力，但是它們都需要耗費大量的時間才能實現，而膜工程策略僅需要進行簡單的分子生物學操作即可提高微生物的耐受能力。除此之外，這些耐受策略僅能夠針對某一種特定的脅迫進行改造，而膜工程的改造可以有效應對多種脅迫。

目前，膜工程策略增加工業菌株耐受性的方法主要分為三種：改造細胞膜組分、改造細胞膜功能、改造細胞膜形態。例如，解脂耶式酵母中通過改變甾醇路徑酶ERG3，ERG4，ERG6，ERG12的表達提高了有機溶劑的耐受性；光滑球擬酵母中轉錄因子CgRDS2通過提高細胞膜完整性來抵御鹽脅迫環境；大腸桿菌中通過過表達膜彎曲蛋白擴展細胞膜的表面積從而提高疏水化合物的耐受性。然而，這些方法雖然提高了微生物的耐受性，但是與傳統的菌株改造方法相比，它們的菌株耐受能力仍然較低。此外，這些研究僅僅是對膜組分進行改造，未對膜功能、形態變化等因素進行考慮，而這些也可能是影響其耐受性的關鍵。目前，還未出現將代謝工程與膜工程策略相結合，并且綜合考慮膜組分、膜功能、膜形態等因素的提高微生物耐受性的方法。

發明內容

技術問題：本發明有效解決了釀酒酵母鹽脅迫抗性低的問題，使得釀酒酵母菌株在鹽脅迫條件下生存能力有所提高，為提高釀酒酵母發酵生產大宗化學品的性能提供潛在策略。

技術方案：為了解決上述問題，本發明提供了一種調節釀酒酵母抵御鹽脅迫的方法，通過調控編碼磷脂路徑酶的基因CDS1和CHO1表達來調節釀酒酵母的鹽脅迫抗性。

在本發明的一種實施方式中，所述方法通過模塊化組裝CDS1和CHO1基因后，增強釀酒酵母的鹽脅迫抗性；所述模塊化組裝是：將共表達CDS1基因和CHO1基因的質粒轉入釀酒酵母中，獲得共表達CDS1和CHO1基因的菌株。

在本發明的一種實施方式中，用弱啟動子ADH1表達CDS1基因，用強啟動子TEF1表達CHO1基因。

在本發明的一種實施方式中，所述CDS1基因的核苷酸序列如NCBI上gene ID:852317的核苷酸序列所示。

在本發明的一種實施方式中，所述CHO1基因的核苷酸序列如NCBI上gene ID:856748的核苷酸序列所示。

在本發明的一種實施方式中，所述釀酒酵母是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4741(見https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)。基因型為MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0。

在本發明的一種實施方式中，所述共表達CDS1基因和CHO1基因的質粒是PY17-(ADH1)-CDS1-(TEF1)-CHO1。