[發明專利]抗蟲融合基因、其編碼蛋白、其表達載體及其應用

在審

• 申請號: 201911296329.6
• 申請日: 2019-12-16
• 公開（公告）號: CN111088265A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 鐵健雄
• 申請（專利權）人: 廣州小草農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/62;C07K19/00;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46;A01N37/46;A01P7/04
• 代理公司: 河南科技通律師事務所 41123
• 代理人: 樊羿;張曉輝

本發明公開了一種抗蟲融合基因、其編碼蛋白、其表達載體及其應用，旨在解決昆蟲對殺蟲制劑的抗藥性趨勢不可遏制的技術問題。本發明設計了抗蟲基因和抗蟲融合基因CryAb?VIP3A，還提供了抗蟲融合基因編碼的蛋白，并設計了由抗蟲融合基因構建的表達載體、由表達載體構建的重組菌。將抗蟲融合基因在制備抗蟲植物細胞中應用。將抗蟲融合基因編碼的蛋白在制備抗蟲制劑中應用。本發明抗蟲融合基因能在玉米中穩定表達，避免了原始VIP3A(a)基因單獨轉入植物產生的生物毒性，克服了外源基因表達存在的基因沉默現象，為植物害蟲防治提供更多的選擇，為遏制昆蟲對殺蟲制劑的抗藥性趨勢提供了新的方法。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種抗蟲融合基因、其編碼蛋白、其表達載體及其應用。

背景技術

以農作物為食的害蟲達百萬種之多，造成巨大的經濟損失，嚴重影響作物產量和品質。目前農作物害蟲的防治主要還是依賴于化學農藥，長期大量使用化學農藥對環境和健康造成很大的危害。為了減少環境污染和對人類健康潛在的危害，利用生物技術開發新型藥劑成為研究熱點。

隨著分子生物學技術的發展和基因克隆、DNA操作等技術出現，人類開始將抗蟲基因克隆到工程菌中，進一步獲得了抗性轉基因植株，其中很多已進入大田試驗，甚至有的已經開始大面積種植。

優良目標基因的選擇和克隆是基因工程研究的基礎，現有抗蟲基因的克隆主要有：

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）抗蟲基因：Bt在形成芽孢的過程中產生的殺蟲蛋白晶體，敏感性昆蟲攝取后，在中腸堿性條件下被水解為多肽，可使細胞膜上形成孔道，進而破壞細胞的離子平衡，最終導致細胞裂解，致使昆蟲死亡；蛋白酶抑制劑基因：對維持生物體正常代謝和預防外來蛋白水解酶對基體的破壞起著重要作用。可抑制昆蟲腸道蛋白酶活性，造成昆蟲消化不良，最終因缺乏氨基酸，生長發育受限繼而死亡；植物凝集素基因：含二價金屬離子的糖蛋白，可使昆蟲，尤其是刺吸式口器的昆蟲，紅細胞發生凝聚作用，進而引發死亡；幾丁質酶基因：幾丁質是真菌細胞壁、昆蟲外殼的重要組成部分，幾丁質酶廣是一種泛存在于植物中的內源性蛋白質，具有抵御病原性真菌、食草昆蟲的重要作用；蝎昆蟲毒素基因：可特異性結合于昆蟲神經細胞膜上的鈉離子通道，引起鈉離子的通透性改變，從而使昆蟲麻痹、死亡。

目前從大量的Bt菌株中分離出至少90種基因編碼的殺蟲結晶蛋白。昆蟲病原菌Bt基因產生Cry、Cyt和Vips等3種蛋白。Cry和Cyt蛋白產生聚集在包涵體或旁孔晶體中的殺蟲蛋白，Cry蛋白根據蛋白結構同源性和寄主范圍，將這些基因劃分為CryI、CryII、CryIII和CryIV4個主要類型。其中，CryI高抗鱗翅目昆蟲，CryII抗鱗翅目和和雙翅目昆蟲，CryⅢ高抗鞘翅目昆蟲，CryIV抗雙翅目昆蟲。近年又相繼發現了兼抗鱗翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白（CryV）、抗線蟲的Bt毒蛋白（CryVI）。大多數蘇云金芽孢桿菌株系可產生幾種殺蟲結晶蛋白，但每一種殺蟲結晶蛋白寄主范圍相當狹窄。

除上述幾類外，還有豌豆脂氧合酶基因、昆蟲雌蟲不育蛋白因子基因、昆蟲保幼激素脂酶基因、昆蟲神經激素基因等等。

但是，上述轉抗蟲基因的抗蟲植物在應用中的潛在問題也日益顯露，影響其持續利用。如：將原始抗蟲基因直接應用到轉基因植物中獲得的轉基因植物抗蟲性很低、抗蟲性效果差，毒蛋白的表達量低量也很低且表達產物不穩定，不能滿足農業生產上的蟲害防治需求，大多難以應用；隨著抗蟲基因的大范圍應用，昆蟲還會對殺蟲蛋白產生抗性；抗蟲基因的抗蟲譜窄；外源基因在植物體內的表達存在基因“沉默”現象，等等。

因此，研發新的抗蟲基因或充分利用現有抗蟲基因資源來應對昆蟲對殺蟲制劑的抗藥性趨勢，已成為當務之急。

發明內容