[發明專利]用蓮類黃酮C-糖基轉移酶UGT708N2合成類黃酮C-糖苷的方法

有效

• 申請號: 201911289779.2
• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN111041056B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 王亮生;馮成庸;李珊珊;吳倩
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12P19/60
• 分類號: C12P19/60;C12P19/18;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京漢智嘉成知識產權代理有限公司 11682
• 代理人: 高芬芳;蔣宇星

1.一種制備類黃酮C-糖苷的方法，其特征在于：使用如下所示的蛋白質催化底物合成類黃酮C-糖苷：

所述蛋白質的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

所述蛋白質催化底物2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖合成2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷；或

所述蛋白質催化底物2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖合成2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

2.一種制備類黃酮C-糖苷的方法，包括如下步驟：

（1）將含有核苷酸序列如序列表中序列3所示的編碼基因的重組載體轉入工程菌中，得到含有重組載體的工程菌；將所述含有重組載體的工程菌添加至培養基中進行孵育并誘導重組蛋白表達，收集并重懸菌體，得到工程菌液；

（2）將底物加入所述步驟（1）得到的工程菌液中，進行孵育，收集上清，目標產物位于上清液中；將所述上清液進行酸化處理，隨后洗脫、純化，即得到類黃酮C-糖苷；

所述底物為2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖，得到的類黃酮C-糖苷為2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷；或

所述底物為2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖，得到的類黃酮C-糖苷為2-羥基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。

3.根據權利要求2所述的制備類黃酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的所述重組載體是將含有核苷酸序列如序列表中序列3所示的編碼基因轉入pET28a（+）載體中得到的重組載體；所述工程菌為大腸桿菌Rosetta 2（DE3）。

4.根據權利要求2所述的制備類黃酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的孵育是在溫度為37°C、轉速為200 rpm的條件下進行孵育，至OD₆₀₀為0.5~0.7之間；所述誘導重組蛋白表達是加入終濃度為0.3 mM的異丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷，置于22°C和150 rpm條件下誘導重組蛋白表達；所述重懸菌體是用含2%木糖或阿拉伯糖的M9基本培養基重懸菌體使菌體溶液的吸光值OD₆₀₀介于3.0~6.0之間。

5.根據權利要求2所述的制備類黃酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的孵育是將工程菌液置于30°C和150 rpm條件下孵育12 h，每隔2 h向菌液中添加濃度為200 μM的底物；所述洗脫是利用20-60%甲醇水進行線性梯度洗脫。