[發(fā)明專利]一種來源于地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶高溫突變體

有效

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• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN110923221B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 張大偉;付剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發(fā)明提供一種來源于地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶高溫突變體，以來源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)堿性蛋白酶基因subC為基礎，通過定點突變PCR技術獲得了2個堿性蛋白酶突變體subCMtemp1和subCMtemp2，并分別構建了表達上述突變體的重組菌枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵上清液酶活在45℃條件下處理10min后酶活殘留水平分別為57％和67％，比表達野生型堿性蛋白酶subC的枯草芽孢桿菌酶活殘留水平(17％)有了顯著的提高。

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白工程改造領域，具體涉及一種新型的堿性蛋白酶突變體蛋白。

背景技術

堿性蛋白酶(alkaline protease)指在堿性條件下(pH在9～11范圍內)能夠水解蛋白質肽鍵的酶，其主要成分是一種內切蛋白酶，催化部位為絲氨酸，廣泛應用于洗滌劑、食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)。目前所采用的堿性蛋白酶多是經(jīng)細菌原生質體誘變方法造育的來源于枯草芽孢桿菌2709通過深層發(fā)酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，屬于一種絲氨酸堿性蛋白酶，它能水解蛋白質分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質的能力。生產工藝是采用微濾超濾膜分離、噴霧干燥或真空冷凍干燥等先進技術。堿性蛋白酶是目前市場上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力，特別對血漬、汗?jié)n、奶漬、油漬等蛋白類污垢,具有獨特的洗滌效果，是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，約占全世界每年總銷售量的60％左右。

定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向編碼目的蛋白的DNA片段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點突變技術是當前生物、醫(yī)學各領域研究中的一種重要實驗手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，也是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于人類了解蛋白質結構和功能的關系，探討蛋白質的結構/結構域。近幾年酶的定點突變技術應用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特異性、提高熱穩(wěn)定性、對映立體選擇等方面。酶的定點突變技術為酶的結構和功能開辟了嶄新的途徑，在工業(yè)、農業(yè)、食品業(yè)、環(huán)境等領域取得巨大成功。

發(fā)明內容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術問題提供了一種在較高溫度條件下酶活力得到顯著提高的堿性蛋白酶突變體。

所述突變體是由地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)堿性蛋白酶基因subC的成熟肽出發(fā)，運用定點突變技術獲得的，并在枯草芽孢桿菌中進行表達。

本發(fā)明一方面提供了一種堿性蛋白酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的堿性蛋白酶的第283位氨基酸由Ala變?yōu)镮le，突變體氨基酸序列為SEQ ID NO:2。

本發(fā)明一方面提供了一種堿性蛋白酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:2的堿性蛋白酶的第306位氨基酸由Gly變?yōu)镃ys，突變體氨基酸序列為SEQ ID NO:3。

本發(fā)明以來源于地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶subC為基礎，通過定點突變技術獲得了兩個堿性蛋白酶突變體subCMtemp1和subCMtemp2，并在枯草芽孢桿菌中對上述突變體進行了發(fā)酵，其發(fā)酵上清液酶活在45℃條件下處理10min后酶活殘留水平分別為57％和67％，比表達野生型堿性蛋白酶subC的枯草芽孢桿菌酶活殘留水平(17％)有了顯著的提高。

附圖說明

圖1：堿性蛋白酶表達載體的質粒圖譜；

圖2：堿性蛋白酶突變體經(jīng)熱處理后的相對酶活柱形圖。

具體實施方式