[發明專利]一種菠蘿蛋白酶提取的新工藝

在審

• 申請號: 201911277497.0
• 申請日: 2019-12-13
• 公開（公告）號: CN112980817A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 湯勇錚
• 申請（專利權）人: 南京科技職業學院
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種菠蘿蛋白酶提取的新工藝；本發明是這樣來實現的：從新鮮菠蘿廢皮提取菠蘿蛋白酶，通過超聲冷凍技術純化制備菠蘿蛋白酶，將純化制備得到的菠蘿蛋白酶在280nm波長下測定其吸光度值；與普通攪拌純化制備方法比較溶液中硫酸根離子殘留量和酶比活力。發現超聲冰浴方式透析時，所得到的菠蘿蛋白酶純度高、比活力大。可治療水腫，多種炎癥并有健胃消食作用；也可作為食品添加劑用于肉質嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產等。

技術領域：本發明屬于生物化學酶的純化制備領域，具體涉及一種菠蘿蛋白酶的純化制備方法。

背景技術：菠蘿蛋白酶（EC 3、4、22、3），是存在菠蘿植株中的含半胱氨酸殘基的蛋白水解酶，可治療水腫，多種炎癥并有健胃消食作用；也可作為食品添加劑用于肉質嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產等。菠蘿蛋白酶是一種較不穩定的酶，提取過程中的工藝步驟對其產品活力有較大影響。

菠蘿蛋白酶一般從菠蘿廢皮中提取，其果、莖、柄和葉片中都含有菠蘿蛋白酶；菠蘿蛋白酶相對分子質量為33000，淺黃色粉末，等電點為9.5，微溶于水。

發明內容：本發明涉及一種菠蘿蛋白酶的純化制備方法。

本發明是這樣來實現的：從新鮮菠蘿廢皮提取菠蘿蛋白酶，通過超聲冷凍技術純化制備菠蘿蛋白酶， 將純化制備得到的菠蘿蛋白酶在280nm波長下測定其吸光度值；與普通攪拌純化制備方法比較溶液中硫酸根離子殘留量和酶比活力。發現超聲冰浴方式透析時，所得到的菠蘿蛋白酶純度高、比活力大。

本發明的純化制備過程包含如下步驟：

將稱量好的菠蘿皮原料300g壓榨，加入pH7.5的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液600mL，放入攪拌機內攪拌15min，使之充分攪拌均勻；4層紗布過濾。濾液4000rpm離心5min，取上清液加入硫酸銨可見沉淀析出；將沉淀轉移入透析袋，超聲冰浴方式進行透析去除無機離子和有機小分子15min，反復三次，用鋇離子檢測殘余硫酸根離子；紫外可見分光光度計280nm波長測定酶溶液吸光度，檢測酶比活力。

具體實施方式:: 以下通過實施實例對本發明作進一步說明，但其并不限制本發明的保護范圍。

實施例1：

配制濃度分別為10%的酶液，取1mL，加入0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.5）和0.5%硫代硫酸鈉4.5mL、0.5%EDTA4.5mL定容至100mL；于37℃下預熱10min，加入1%酪蛋白溶液10mL準確反應10min，再加入10%三氯醋酸3mL終止酶促反應，上清液于280nm波長測定吸光度值。

實施例2

0-1000μg/mL蛋白質標準曲線的繪制。

分別吸取牛血清蛋白的標準液（1000μg/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，依次加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL水，混勻后，分別與5.0mL5%考馬斯亮藍混合，振搖后在595nm測定吸光度值。以吸光度為橫坐標，牛血清蛋白濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

吸取10%菠蘿蛋白酶1mL同法操作讀取吸光度值，標準曲線中查找相應的濃度。

實施例3

取2mL氯化鋇0.01mol/L溶液放入一支試管滴加2-3滴透析外液至試管中；超聲冰浴15min，三次換水后無白色沉淀，普通攪拌方法4次換水后仍有渾濁。