[發明專利]一種耐鹽六磷酸海藻糖水解酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201911275657.8
• 申請日: 2019-12-12
• 公開（公告）號: CN111041016B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 許波;楊雁霞;黃遵錫;吳倩;楊云娟;李俊俊;唐湘華
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/52;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 王學芝

本發明公開了一種耐鹽六磷酸海藻糖水解酶及其制備方法和應用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共545個氨基酸，理論分子量為65.21kDa。該耐鹽六磷酸海藻糖水解酶最適作用pH為7.5，在pH 7.0～8.0范圍內處理1h后，酶活剩余90％以上；最適作用溫度為30℃，在37℃條件下耐受1h對酶活基本無影響。該酶活性隨著NaCl濃度的提高而增強，在NaCl濃度為4M時酶活性達到最大(約35倍)。在0.5?5M NaCl條件下處理1h和24h后酶活性仍然增強，在5M NaCl條件下處理24h其酶活提高43倍，典型的耐鹽酶，具有用做報告基因及在其它鹽環境中應用的潛力。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種耐鹽六磷酸海藻糖水解酶及其制備方法和應用。

背景技術

六磷酸海藻糖水解酶(EC3.2.1.93)能催化水解六磷酸海藻糖生成葡萄糖和六磷酸葡萄糖，并可通過糖酵解途徑進一步代謝。海藻糖廣泛存在于各種生物中，在應對高溫及滲透壓力方面起重要作用。當外部環境的滲透壓低時，大腸桿菌吸收外源性海藻糖作為碳和能量來源，吸收的海藻糖通過特異性磷酸酶系統(PTS)磷酸化成六磷酸海藻糖(T6P)，而六磷酸海藻糖又可被六磷酸海藻糖水解酶水解。耐鹽六磷酸海藻糖水解酶在高鹽濃度中具有較高的酶活，在研究耐鹽菌株等方面用作報告基因有顯著優勢。此外，還可從耐鹽六磷酸海藻糖水解酶的組成特性獲得啟發，對用于高鹽廢水處理及食品加工的生物酶人工修飾改造，提高酶在處理廢水及食品加工方面的穩定性及利用率。因此開發適用于鹽環境的六磷酸海藻糖水解酶具有重要意義。

近年來，報道的六磷酸海藻糖水解酶主要來源于Bacillus licheni formis(Chuang et al.，2012；Ong et al.，2014；Chen et al.，2015；L in et al.，2016)，Bacillus sp.GP16(Karelov et al.，2003)，Lactoba cillus acidophilus(Duong etal.，2006)，Klebsiella pneumoniae Strain(Wu et al.，2011)，Bacillus subtilis(Sniezko et al.，1998)，Escheric hia coli(Rimmele and Boos，1994)。但只有少數六磷酸海藻糖水解酶基因(Rimmele and Boos，1994；Karelov et al.，2003；Chuang et al.，2012；Ong et al.，2014；Chen et al.，2015)被克隆、表達并鑒定。其中，來源于B.licheniformis(Chuang et al.，2012)的六磷酸海藻糖水解酶(BlTreA)具有較好的耐鹽性，酶活在100MM NaCl中增強3.1倍。

動物胃腸道內存在大量微生物，它們與動物機體生理功能密切相關，被認為是星球上最為密集的微生物生態系統。這些微生物區系之間及微生物與動物宿主之間形成了相互依存，相互作用的不可分割的整體。棲息于胃腸道的微生物面臨著如酸、膽鹽、滲透壓等壓力，研究表明相對高滲的胃腸道腔(相當于0.3Mol/L NaCl)及飲食的變化可導致胃腸道中滲透壓力的產生，為適應外部環境壓力的改變，微生物的某些基因可能被激活，從而產生適應壓力環境的特殊蛋白。目前，利用純培養技術研究者們已從嗜鹽和耐鹽微生物中獲得了各類耐鹽基因，然而所得的耐鹽基因數量仍比分離獲得的耐鹽菌數量要少得多。隨著后基因組時代的到來，宏基因組學技術的出現避開了微生物分離培養的問題，極大地擴展了微生物資源的利用空間，為尋找和發現新的耐鹽功能基因提供了新的研究策略。