[發(fā)明專利]一種基于代謝組學的棗花花蜜致蜜蜂毒性效應(yīng)的研究方法

有效

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• 申請日: 2019-12-11
• 公開（公告）號: CN111122757B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭先云;馬衛(wèi)華
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N33/50
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

1.一種基于代謝組學的棗花花蜜致蜜蜂毒性效應(yīng)的研究方法，其特征在于：收集棗花病蜜蜂并以健康蜜蜂作為對照，采集這兩組蜜蜂的血淋巴，采用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合多維統(tǒng)計分析對樣本進行全譜分析，獲得一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，隨后采用XCMS軟件對數(shù)據(jù)進行峰提取和代謝物鑒定，使用SIMCA軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行多維統(tǒng)計分析；從代謝物中篩選與蜜蜂棗花病有關(guān)的血淋巴異常代謝物靶標和代謝輪廓，獲得代謝指紋圖譜；在棗花病組中顯著上調(diào)的，VIP值5的代謝產(chǎn)物17種，下調(diào)的代謝產(chǎn)物18種；以血淋巴代謝物靶標分析和代謝輪廓分析為指導，開展棗花花蜜對蜜蜂致病性的追蹤、篩選，闡述棗花花蜜對蜜蜂毒性的作用機制；顯著差異的代謝產(chǎn)物主要富集到5個代謝通路，這5個相關(guān)代謝通路參與了蜜蜂對棗花花蜜的代謝過程；

具體步驟如下：

（1）采樣提取代謝物：采集患棗花病的蜜蜂，并以同期健康蜜蜂作為對照，帶回實驗室后采集血淋巴并提取代謝物；

（2）分離代謝物：對提取的代謝物采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)UHPLC，HILIC色譜柱進行分離；色譜流動相A：水+25 mM乙酸銨+25 mM氨水，B：乙腈；色譜梯度洗脫程序如下：0-0.5 min，95% B；0.5-7 min，B從95%線性變化至65 %；7-9 min，B從65%線性變化至40%；9-10 min，B維持在40%；10-11.1 min，B從40%線性變化至95%；11.1-16min，B維持在95%；

（3）分析樣品：樣品經(jīng)UHPLC分離后用Triple-TOF 5600質(zhì)譜儀AB SCIEX進行質(zhì)譜分析；每例樣品分別采用電噴霧電離進行正離子和負離子模式檢測；

（4）分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)：用XCMS軟件對數(shù)據(jù)進行峰提取和代謝物鑒定，并使用SIMCA軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行多維統(tǒng)計分析；

棗花病蜜蜂血淋巴中具有生物學意義的差異代謝物為：上調(diào)的代謝產(chǎn)物有117個，下調(diào)的代謝產(chǎn)物為82個；其中VIP5的在棗花病組中顯著上調(diào)的17種代謝標志物：葡萄糖、D-6-磷酸葡萄糖、半乳糖醇、溶血磷脂酰膽堿（18:1（9Z））、溶血磷脂酰膽堿（18:0）、溶血磷脂酰膽堿（16:0）、溶血磷脂酰乙醇胺（18:3）、溶血磷脂酰膽堿（18:2）、L-谷氨酰胺、N-果糖基異亮氨酸、亞油酸、3-磷酸甘油、3-羥基-3-甲基谷氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、次黃（嘌呤核）苷、3′-磷酸腺苷、尿苷5′-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖；棗花病組中顯著下調(diào)的代謝標志物有18種：蔗糖、海藻糖、麥拉齊糖、酮亮氨酸、異麥芽酮糖、奎寧酸、10-羥基癸酸、尼古丁、果糖、泛醇、麥芽糖、磷酰膽堿、葡萄糖酸酯、犬尿喹啉酸、肉豆蔻酸、咪唑丙烯酸、3-氧代戊酸甲酯、L-蘋果酸；

根據(jù)代謝通路的p值和通路的重要值，尋找到受棗花蜜顯著影響的代謝通路：ABC轉(zhuǎn)運蛋白，氨基酸生物合成，淀粉及果糖代謝，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，蛋白質(zhì)消化及吸收這五個代謝通路為蜜蜂食用棗花花蜜后的重要代謝通路，參與了蜜蜂代謝棗花花蜜的主要代謝過程，形成相互交錯的代謝網(wǎng)絡(luò)，完整闡釋了棗花花蜜對蜜蜂的毒性作用機制。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于代謝組學的棗花花蜜致蜜蜂毒性效應(yīng)的研究方法，其特征在于：步驟（1）中采樣的具體方法為：在棗花流蜜期收集已取食棗花花蜜并在蜂巢前爬行的出現(xiàn)棗花病癥狀的蜜蜂，并同時采集未取食棗花花蜜的健康蜜蜂作為對照，用紗籠迅速帶回實驗室；取蜜蜂血淋巴，每組取六個樣；

代謝物的提取方法為：每個樣本取30μL血淋巴，加入1 mL預冷v/v/v為甲醇/乙腈/水=2:2:1，混勻，冰浴中超聲60 min，-20℃孵育1h后沉淀蛋白，16000g、4℃離心20 min后，取上清液真空干燥；質(zhì)譜檢測時加入100μL的v/v為1:1的乙腈-水溶液復溶，14000g、4℃離心15min，取上清進樣分析。