[發明專利]還原性糖的一步熒光衍生方法及其應用

在審

• 申請號: 201911266169.0
• 申請日: 2019-12-11
• 公開（公告）號: CN110954517A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 張英;薛向東;王仲孚;李嬌;唐夢君;李澄
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N30/06;G01N27/62
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 汪海艷

本發明公開了一種還原性糖的一步熒光衍生方法及其應用。該方法以還原性糖為原料，與熒光標記試劑熒光素?5?氨基?硫脲，在室溫下攪拌反應，生成糖?FTSC衍生物，實現了乳糖、糖醛酸、麥芽糊精以及中藥來源還原性多糖等多種類型糖的標記；對所得到的產物進行質譜結構解析、熒光光譜和顯微活細胞成像研究。結果顯示，標記得到的糖腙衍生物穩定性良好，并且有很高的熒光產率，可用于還原性中性、酸性寡糖的熒光衍生標記及顯微熒光成像檢測。本發明方法反應條件溫和，反應產率高、操作簡單，可用于功能性寡糖探針的規模化合成制備；同時適用于研究還原性寡糖、多糖分子的質譜、色譜、熒光、顯微熒光成像和流式細胞分析等，在生命科學領域有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術及糖生物學分析檢測領域，涉及一種還原性糖的熒光標記方法及其在熒光、質譜和顯微成像研究的應用。

背景技術

還原性糖不僅作為生物體的能源和結構組分，而且還擔負著極為重要的細胞生物學功能，如參與細胞的生長分化、發育、細胞識別與信號轉導、免疫應答等生命過程。眾多研究表明，糖鏈的異常表達與數種惡性疾病如腫瘤的發生發展密切相關，但有關還原性糖類物質的作用機理及致病機制研究卻仍處于探索階段，因此發展熒光標記技術應用于糖類物質的分析檢測及構效關系研究極為重要。

熒光標記技術具有靈敏度高、響應迅速、可視化等優勢，是研究目標分子在機體內的代謝及定位、及其與細胞、蛋白質等相互作用的重要技術，有望為研究糖類物質的作用機理研究提供有效途徑。該技術現已廣泛應用于核酸和蛋白質分析檢測研究中，已成為生物大分子高靈敏度分析檢測不可或缺的工具。

但由于自然界功能性糖類物質結構復雜、且大都表達量低、合成無模板指導，目前尚沒有一套完善的熒光標記技術用于糖類物質的熒光標記。

目前，對糖類物質實現熒光標記主要是基于化學衍生進行，現有糖類物質的熒光標記技術有以下兩類：

直接在還原性末端進行標記：主要基于還原胺化反應，常用的衍生標記試劑有2-氨基吡啶，2-氨基苯甲酸，咔唑-9-乙氧基碳酰肼，2-氨基吖啶酮，1-氨基芘-1,3,6-三磺酸，3-氨基-9-乙基咔唑等。然而，上述衍生標記試劑常用于糖類分子的色譜分離分析，尚不能實現糖類物質的顯微熒光成像研究。

采用高熒光強度的熒光標記試劑標記：為了提高熒光標記產物的量子產率和熒光強度，選用蛋白質組學中常用的高熒光強度的熒光標記試劑，如熒光胺(fluorescamine)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，FITC)等熒光試劑對糖類物質進行標記，由于該類試劑一般是對蛋白質上的氨基直接進行標記，而糖類物質一般沒有氨基，這就需要先通過反應給糖類物質帶上游離的氨基，再與熒光試劑進行標記。

在熒光胺標記多糖時，需先將多糖的羥基(-OH)采用溴化氰(CNBr)活化，再加入熒光胺，該技術標記的多糖-OH基大多數被破壞，在一定程度上破壞了糖的天然結構，從而對其生物學活性很大的影響。

而在使用FITC對糖類物質進行標記時，需通過還原氨化反應給糖鏈的末端連接上一個游離的氨基，再與蛋白質熒光試劑FITC進行反應，該技術需要兩步反應才能完成糖類物質的熒光標記，且需要繁雜的純化步驟，耗時長，并且標記效率較低。

因此，尋找一種條件溫和，并且可以同時進行中性糖鏈、酸性糖檢測的衍生化方法，對還原性糖鏈的分析檢測及功能機制研究具有重要意義。基于此，本發明發展了一種還原性糖的熒光衍生新方法，及其應用于糖類分子在細胞中的顯微成像檢測應用。

發明內容

為了解決背景技術中熒光標記糖類物質方法存在的標記效率低、步驟復雜、耗時長等問題，并克服標記過程對糖生物學活性的影響，本發明提供了一種一步反應高效熒光標記糖類物質的方法，利用一種帶有肼基的熒光素，熒光素-5-氨基硫脲(fluorescein-5-thiosemicarbazide，FTSC)，對還原性糖直接進行熒光標記及分析檢測研究應用。