[發明專利]一種重組犬長效α-干擾素的凍干注射液的制備方法

在審

• 申請號: 201911253028.5
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113018420A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 趙明;魏波;叢雁方;曲信芹;蔣皓靜;劉曉婧
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物制品有限公司;青島動保國家工程技術研究中心有限公司
• 主分類號: A61K38/21
• 分類號: A61K38/21;A61K9/08;A61K47/60;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明涉及動物醫學領域,具體地,本發明公開一種重組犬長效α?干擾素的制備和修飾方法及其凍干注射液的制備方法。本發明重組犬α干擾素采用大腸桿菌包涵體變性純化后復性制備；用聚乙二醇修飾重組犬α干擾素，延長重組犬長效α?干擾素穩定性提高并延長血漿半衰期，降低抗原性和免疫原性，降低毒副作用，這種PEG化修飾必將為犬干擾素的廣泛使用帶來廣闊的前景；本發明重組犬長效α干擾素添加凍干保護劑后的凍干注射液具有低成本、質量穩定、方便運輸的優點。

技術領域:

本發明涉及動物醫學分子免疫學領域，尤其涉及一種重組犬長效α-干擾素的凍干注射液的制備方法。

背景技術

干擾素(INF)是由Isasscs等在進行雞胚細胞流感病毒感染試驗中首次發現的一類能干擾和抑制病毒復制的可溶性細胞分泌物,并將其命名為干擾素 (interferon,INF)。干擾素是一種多功能的細胞因子家族中的一員,由干擾素誘生劑作用于細胞膜后,可使細胞產生一種特異因子,這種因子和細胞DNA中的干擾素基因抑制物結合,解除了干擾素基因的抑制作用,從而合成干擾素。干擾素作用的發揮是一個復雜的過程，通過“INF系統”來實現,表現出一定的抗病毒、免疫調節、抗腫瘤、抗細菌和寄生蟲等作用。

Hiummler等(1987)首先對犬的INF-α基因進行了研究，并報道了犬INF- α基因序列。Devos K等(1992)克隆了犬INF-r基因，楊琪等(2002)克隆了犬INF-r cDNA,并用PRC/CMV2表達載體率先在鼠骨髓瘤細胞中進行表達,張海峰等(2005)實現了重組犬INF-r在大腸桿菌中的高效表達。犬干擾素無論是天然的還是重組的干擾素均具有較強的抗病毒能力，臨床上已經將重組的干擾素應用于防治狂犬病、犬細小病毒病、犬瘟熱等病毒病。

但是在實際的應用當中，仍然存在這一些問題。首先，干擾素作為一種廣譜治療藥物，其作用的特異性不好，對某些疾病的治療不能達到預想的效果，因此需要逐步的優化干擾素的使用方法和條件；例如，其代謝周期較短，發揮作用有限。除此之外，在干擾素的使用過程當中偶爾會出現一些不良反應，例如，白細胞減少、流感樣癥狀、內分泌系統紊亂、具有腎臟毒性、消化系統反應等。這就需要我們利用基因工程的方法來實現對干擾素的改變，降低干擾素的毒副作用。第三，由于動物經濟價值的問題，對獸醫臨床應用主要局限于寵物疾病的治療，而且主要用于輔助治療病毒病和寄生蟲病，因此，需要探索更有效的基因表達系統，提高INF的表達水平和抗病毒活性，降低生產成本。

蛋白質的聚乙二醇修飾蛋白質和肽類分子的化學修飾已經成為生物技術與生物醫學領域的研究熱點，而聚乙二醇(PEG)則是應用最為廣泛的大分子修飾劑之一。PEG化學修飾實際上就是在生物活性分子表面共價連接上親水性PEG長鏈。蛋白質或肽類分子PEG化后，其主要的生物學和生理學功能保持不變，而可同時獲得一些非常期望的性質。很多蛋白質多肽藥物在體內半衰期很短，并且容易引起免疫反應。為了解決這些問題，1977年Davis首次采用聚乙二醇修飾牛血清白蛋白。此后，PEG修飾藥物技術(PEGylation)迅速發展，并廣泛應用于多種蛋白類藥物和非蛋白類藥物的修飾。PEG化學修飾實際上就是在生物活性分子表面共價連接上親水性PEG分子。經過二十多年的發展，PEG修飾藥物技術已經進入了實用期，迄今，已有多個藥物通過FDA批準進入市場，還有更多藥物處于臨床和實驗室研究階段一般認為，經PEG修飾后的藥物，主要有以下方面的優點：

(1)穩定性和延長血漿半衰期

一些以注射方式使用的藥用蛋白，由于在血液中存留的時間過短，在很大程度上限制了其正常藥效的發揮，通過PEG修飾則可以有效延長蛋白在循環系統內的保留時間。聚乙二醇修飾能夠延長蛋白質的體內半衰期的機制至今仍未明確，主要是多種因素共同作用的結果，包括1)由于PEG大分子的共價偶聯，蛋白質分子量增加，使其不易被腎臟代謝，因而在血液的停留時間延長，消除減慢。聚乙二醇修飾增加了蛋白質的有效分子量，腎消除速率減小，半衰期延長；2)PEG線性長鏈的屏蔽作用，使蛋白質不易受蛋白酶的降解，從而延長其體內作用時間；3)PEG蛋白的免疫原性大大降低，難以激發抗體的產生，從而不會通過免疫反應消除。