[發明專利]緩解葉菜類蔬菜種植土壤鎘脅迫的生物制劑及其應用

有效

• 申請號: 201911251846.1
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN111096202B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 王曙光;亓文鈺;宋超
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: A01G22/15
• 分類號: A01G22/15;A01G7/06;A01G13/00;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種緩解葉菜類蔬菜種植土壤鎘脅迫的生物制劑，是由采用枯草芽孢桿菌168生物法制得的納米硒與枯草芽孢桿活菌數量≥1×10⁹/g的枯草芽孢桿菌在水中均勻混合制成；其中，所述采用枯草芽孢桿菌168生物法制得的納米硒以如下步驟制備：

(1)在滅菌后的添加了50～600mmol L^-1亞硒酸鈉的LB培養基中，按體積比的量接種4～10％的枯草芽孢桿菌168活菌體，然后將培養瓶置30±2℃的搖瓶培養箱中在150-300轉/分鐘的條件下進行好氧培養0.5～7d，之后以4000g～4500g離心10～20分鐘，收集沉淀即獲得枯草芽孢桿菌與其代謝產物納米硒的混合物；

(2)用0.9％NaCl溶液洗滌所得的沉淀，然后加入液氮并杵打使沉淀破碎；再以100-300W條件超聲處理5～10分鐘使沉淀混合物粒徑達到200nm以下，用Tris-HCl緩沖液以10000g，5min條件連續離心洗滌破碎產物2-3次；將離心洗滌收集到的產物懸浮于去離子水中，即得到含有納米硒和菌細胞碎片的懸浮液；

(3)將步驟(2)制得的懸浮液轉移到試管中，按體積比1:2～2:1加入正辛醇混合；在4℃靜置沉淀14～24h；液體出現分層：上層是正辛醇，兩相界面是菌細胞碎片，下層是納米硒顆粒懸濁液；分離出下層的納米硒顆粒懸濁液，3500g離心10min，沉淀物用氯仿、乙醇和蒸餾水分別洗滌至完全去除菌細胞碎片后得到納米硒；將清潔后的納米硒粒子在去離子水中定量為200-400mg/L的濃度制得納米硒水溶液，儲存在4℃備用；

其特征是：

所述生物制劑中納米硒與枯草芽孢桿菌 混合比例是：每15L水中混有300mL～700mL的濃度為200～400mg L^-1納米硒水溶液和1kg～4kg枯草芽孢桿菌。

2.按照權利要求1所述緩解葉菜類蔬菜種植土壤鎘脅迫的生物制劑，其特征是：所述納米硒與枯草芽孢桿混合比例是：每15L水中混有500mL的濃度為300mg L^-1納米硒水溶液和4kg枯草芽孢桿菌。

3.權利要求1或2所述緩解葉菜類蔬菜種植土壤鎘脅迫的生物制劑在緩解小白菜或油菜種植土壤鎘脅迫中的應用，其特征在于，應用方法是：選擇一塊種植小白菜或油菜的菜地，分為3片區域先預處理土壤，使土壤中重金屬鎘濃度分別為0、10mg/kg、20mg/kg，放置兩周，期間保持土壤濕度恒定；然后以每0.1平方米面積種植16～20棵菜的比例種植小白菜，一周后間苗至每0.1平方米面積12棵；期間準備權利要求1或2所述的生物制劑在出苗后7-12天進行第一次葉面噴施，在生長期第15-20天進行第二次葉面噴施，在收獲前5-10天第三次葉面噴施；將收獲的小白菜或油菜用蒸餾水清洗干凈根部及葉片，檢測根部及葉片的鎘含量以評價所述生物制劑緩解葉菜類蔬菜種植土壤鎘脅迫的狀況；其中所述生物制劑組分中納米硒與枯草芽孢桿混合比例是：每15L水中混有500mL的濃度為300mg L^-1納米硒水溶液納米硒和4kg活菌數量≥1×10⁹/g的枯草芽孢桿菌；所述土壤中重金屬鎘濃度設置為20mg/kg。