[發(fā)明專利]利用NASBA檢測REV的方法及使用的成套試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911249872.0
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113025746B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張巖;馬銀平;牟海青;陳燕旌;邊素瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發(fā)明公開了利用NASBA檢測REV的方法及使用的成套試劑。成套試劑由“引物F和引物R組成的引物對”和探針組組成；引物對的靶序列含有SEQ ID NO：9所示的特異DNA片段；探針組由SEQ ID NO：3所示的上游探針和SEQ ID NO：4所示的下游探針組成。采用本發(fā)明提供的成套試劑檢測REV，特異性好(從ALV、MDV、CIAV和REV中準(zhǔn)確鑒定出REV)且靈敏度高(靈敏度為2×10個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系)，適應(yīng)于病毒含量低的樣品中REV的檢測，而且檢測方法簡便、快速(1h內(nèi)完成檢測)、準(zhǔn)確。本發(fā)明具有重大的推廣價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用NASBA檢測REV的方法及使用的成套試劑。

背景技術(shù)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)可以感染火雞、雞、鴨、鵝、鵪鶉等多種家禽和一些野鳥，引起禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病存在不同類型癥狀和病變，一般包括矮小病綜合征、淋巴組織和其它組織的慢性腫瘤、急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生性腫瘤等，還嚴(yán)重影響雞的生長發(fā)育和免疫反應(yīng)(即造成亞臨床感染狀態(tài)下的免疫抑制)，甚至可與雞貧血病病毒、馬立克氏病病毒等互相作用，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失，已成為當(dāng)前嚴(yán)重危害我國養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一。弱毒疫苗中REV的污染是困擾我國養(yǎng)雞業(yè)的一個重要問題。特別是在1周齡內(nèi)使用的弱毒疫苗，如果污染REV，造成的免疫抑制最為嚴(yán)重。因此，能夠及時檢測REV是有效預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病的基礎(chǔ)。

目前，常用的檢測REV的方法包括病理組織檢查、ELISA、試紙條、常規(guī)PCR技術(shù)、雜交芯片法等等。病理組織檢查方法耗時長，對動物本身有破壞性，而且對于操作著有較高的經(jīng)驗(yàn)要求。ELISA以及試紙條檢測方法，靈敏度較低，容易造成檢測結(jié)果假陰性。常規(guī)PCR技術(shù)儀器價格昂貴、操作繁瑣且耗時較長，在基層的推廣使用受到極大的限制。雜交芯片法成本較高、操作比較復(fù)雜且依賴較多昂貴的儀器。因此，迫切需要建立一種操作方便、特異性好且靈敏度高的檢測REV的方法。

NASBA(Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù))是一種擴(kuò)增RNA的新型技術(shù)，其以RNA為模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實(shí)時觀測檢測結(jié)果。該技術(shù)不需要模板的熱變性、長時間循環(huán)擴(kuò)增等過程，而是由一對帶有T7啟動子序列的引物介導(dǎo)，在體外特異性并連續(xù)均一的對單鏈RNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。擴(kuò)增效率方面，PCR擴(kuò)增需要約20個循環(huán)可將DNA模板擴(kuò)增10⁹倍，而NASBA只需4-5個循環(huán)就可將RNA擴(kuò)增10⁹倍。靈敏度方面，NASBA可以檢測到溶液中低于10copies/μL的痕量靶標(biāo)，而PCR的檢測限在100copies/μL左右。特異性方面，由于NASBA在反應(yīng)中無需加熱變性步驟，不受樣品中DNA、肝素、EDTA、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白和脂質(zhì)等污染的影響，更適合粗提樣品的直接擴(kuò)增。由于NASBA對模板RNA的高效擴(kuò)增，大大縮短了反應(yīng)時間，從而降低了酶促反應(yīng)過程中核苷酸的錯配幾率。由此可見，NASBA的擴(kuò)增效率、靈敏度和特異性均都高于RT-PCR技術(shù)。此外，NASBA的儀器成本非常低廉，反應(yīng)條件為41℃，水浴鍋即可滿足，不需要復(fù)雜的升降溫PCR設(shè)備。NASBA還具有操作簡單、無需產(chǎn)物開蓋環(huán)節(jié)，避免交叉污染等優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異且靈敏的檢測REV的方法。

本發(fā)明首先保護(hù)檢測REV的成套試劑，可包括引物對和探針組；

引物對可由引物F和引物R組成；引物對的靶序列可含有特異DNA片段；特異DNA片段的核苷酸序列可如SEQ ID NO：9所示；

探針組可包括上游探針和下游探針；

上游探針可為8-15個核苷酸組成的單鏈核酸分子，與特異DNA片段中的部分區(qū)段相同或互補(bǔ)；

下游探針可為8-15個核苷酸組成的單鏈核酸分子，與特異DNA片段中的部分區(qū)段相同或互補(bǔ)；