[發明專利]一種用于多種血栓標志物檢測的蛋白芯片及其制備方法

在審

• 申請號: 201911249276.2
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN111024941A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 朱旭國;泮鋒綱;丁俊杰;施啟堯
• 申請（專利權）人: 江蘇三聯生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/531;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于多種血栓標志物聯合檢測的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制備方法包括如下步驟：(1)黑玻片預處理；(2)抗體溶液點樣；(3)封閉工藝；制得所述蛋白芯片。本發明的蛋白芯片用于檢測多種血栓標志物濃度，防范和降低血栓風險，指導血栓治療。本發明產品是同時包含有TAT（凝血酶?抗凝血酶復合物）、PIC（纖溶酶?α2抗纖溶酶復合物）、tPAIC（組織型纖溶酶原激活物?纖溶酶原激活抑制復合物）、TM（血栓調節蛋白）、FDP（纖維蛋白原降解產物）和DD（D?二聚體）6個指標的蛋白芯片診斷試劑盒。不僅是首次使用蛋白芯片技術檢測這些指標，更具有快速、高效、簡便、低成本等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種用于檢測多種血栓標志物的蛋白芯片及其制備方法。

背景技術

凝血七項以及凝血因子篩查基本屬于血栓形成后的被動檢測，對于血栓形成前卻并不敏感。相比于發現血栓后的溶栓治療，在血栓形成前及時發現血栓風險，并及時采取措施顯得尤為重要。針對血栓形成之前和血栓形成早期的臨床診斷問題，日本希森美康公司首次提出新血栓四項(TAT，TM，PIC，tPAIC)，再加上纖溶系統的FDP和DD兩個指標的聯合檢測，可以對血栓起到早發現、早治療的作用。

目前新血栓四項標志物的檢測手段十分有限。雖然少數公司開發了磁珠法化學發光免疫產品，但是存在價格昂貴，效率不高，多個指標檢測需要各自獨立的定標和質控，操作繁瑣。而且由于FDP和DD需要用另外的血凝儀器測定，并不利于血栓病人快速、及時、頻繁的臨床監測和監測。

利用三聯生物已有的硬基質蛋白芯片檢測平臺，將血栓新四項、FDP、DD等指標的檢測集成到一張蛋白芯片上，開發了多種血栓標志物檢測芯片，可以在血栓形成的早期進行有效診斷，并且輔助監測抗血栓藥物的治療效果。相對于已有產品，蛋白芯片聯檢在提高效率、降低成本、簡便操作等方面具有明顯的優勢。

(1)TAT(凝血酶-抗凝血酶復合物)

凝血酶(thrombin)是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，具有與胰凝乳蛋白酶相似的序列與結構。它含A、B兩條多肽鏈，由一個鏈間二硫鍵相連。β鏈為功能鏈，具有典型的絲氨酸蛋白水解酶折疊結構，含有1個位于兩個β折疊桶之間的活性中心，2個外結合位點，1個Na離子結合位點，一個自我催化水解環以及一個W60d環。凝血酶具有Na離子誘導的變構酶特性，在血液中有Na離子結合型和Na離子解離型兩種構象。這兩種構象是可以相互轉化的，其相互轉化的部分機理是由于效應因子或底物結合到凝血酶的特定位點而引起構象發生變化和能量轉移，從而改變了Na離子結合與解離的平衡狀態^[1]。

凝血酶直接作用于血液凝固過程的最后一步，促使血漿中的可溶性纖維蛋白原轉變成不溶的纖維蛋白，從而達到速效止血的目的。而且還能促進上皮細胞的有絲分裂，加速創傷愈合，是一種速效的局部止血藥。凝血酶適用于結扎止血困難的小血管、毛細血管、實質性臟器的出血及其他各種出血。還具有激活受體，產生細胞生物學效應，如誘發炎癥、誘導細胞釋放細胞因子、引起細胞增殖、組織器官再生等。中樞神經系統的凝血酶還具有神經毒性，會引起腦細胞損傷。

凝血酶半衰期較短，很難檢測到，因此可以檢測凝血酶與抗凝血酶所形成的復合物。升高說明與DIC，DVT，PE以及心房顫動等其他凝血系統激活狀態有關^[2]。

(2)PIC(纖溶酶-α2抗纖溶酶復合物)

纖溶酶原是纖溶酶的非活性形式，主要在肝臟中合成，主要的器官和組織也會表達。在生理狀態下，纖溶酶原通過活性環剪切后轉化成纖溶酶。活化的纖溶酶具有廣泛的底物特性，包括纖維蛋白、纖維蛋白原、補體成分3、補體成分5等。纖溶酶也可以靶向關鍵的凝血酶原激活劑tPA和uPA，從而產生正反饋環。有活性的纖溶酶在纖溶和止血、細胞外基質降解、細胞遷移、組織重塑、傷口愈合、血管生成、炎癥和腫瘤細胞遷移等生理和病理過程中具有重要作用。