[發明專利]一種促進枯草芽孢桿菌自然生長轉化的培養基組合及其轉化方法

有效

• 申請號: 201911243090.6
• 申請日: 2019-12-06
• 公開（公告）號: CN110747151B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 張玲華;賈軍皓;楚品品;曹丁;馬苗鵬;鄧錦波;明飛平
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種促進枯草芽孢桿菌自然生長轉化的培養基組合及其轉化方法。所述培養基組合包括培養基1和培養基2。本發明利用含有特殊營養物質配方的培養基，高效獲得枯草芽孢桿菌感受態細胞，配合自然轉化法，更高效，更快速獲得有益重組子。進而改善了枯草芽孢桿菌的只能依賴電轉化的復雜方法，大大的降低了轉化成本，為基于枯草芽孢桿菌的蛋白的定向進化和代謝工程奠定了基礎。本發明技術克服了傳統轉化技術缺點，方法簡便易行，轉化效率高，便于普及。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，更具體地，涉及一種制備枯草芽孢桿菌感受態細胞的培養基組合和促進其自然生長轉化的技術。

背景技術

枯草芽孢桿菌bacillus subtilis是一種廣泛分布嗜溫、好氧并產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，已被美國食品藥品監管局(FDA)認定為GRAS(Generally recongnized assafe)菌株。枯草芽孢桿菌具有很強的抗逆性，并能分泌大量酶類和產生抗菌物質。因此，一方面作為活菌劑被廣泛應用在飼料，生防，環保等領域，另一方面作為表達系統在外源蛋白和代謝產物的生產中發揮重要作用。但是，枯草芽孢桿菌作為表達系統，其轉化效率遠遠低于大腸桿菌，一方面限制了其在蛋白質工程(如定向進化，蛋白質突變體庫等)的應用；另一方面限制了枯草芽孢桿菌的代謝工程改造(如多基因同時編輯，多基因協同表達等)。

針對于提高枯草芽孢桿菌的轉化率，以便于在枯草芽孢桿菌中進行酶定向進化和代謝工程改造。目前報道的提高枯草芽孢桿菌轉化效率的方法主要有三種：一是利用多聚體質粒進行轉化，該方法需要構建多聚體的質粒；二是電穿孔法，該方法需要高濃度的甘露醇和山梨醇去創造細胞高滲透壓的環境；三是原生質法，由于原生質體脆弱，是制備枯草芽孢桿菌原生質體困難且十分繁瑣，同時還需要用聚乙二醇去促進DNA進入。

這三種方法雖然可以提高枯草芽孢桿菌的轉化效率，但這些方法工作量大，復雜，耗時且不易掌握。因此需要一種簡單，易于操作的高效轉化普通質粒的方法。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的不足：(1)傳統的電擊轉化需要特殊儀器，且不是所有質粒均可以對枯草芽孢桿菌電擊轉化成功；(2)普通的化學轉化需要改造受體菌的基因，上調comK基因，對質粒進行改造，操作復雜；(3)枯草芽孢桿菌制備原生質體困難，轉化效率極低，提供一種促進枯草芽孢桿菌自然生長轉化的培養基及其轉化方法，利用特殊的培養基，獲得自然生長的枯草芽孢桿菌感受態細胞，接著使用自然生長轉化技術，從而使枯草芽孢桿菌可以更簡單，易操作的轉化普通質粒。

本發明的第一個目的是提供一種促進枯草芽孢桿菌自然生長轉化的培養基組合。

本發明的第二個目的是提供一種制備枯草芽孢桿菌感受態細胞的方法。

本發明的第三個目的是提供一種轉化枯草芽孢桿菌的方法。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：

本發明要求保護一種促進枯草芽孢桿菌自然生長轉化的培養基組合，包括培養基1和培養基2，

其中，培養基1含有以下組分：(NH₄)₂SO₄ 1～4g/L、K₂HPO₄ 2～6g/L、KH₂PO₄4～6g/L、二水檸檬酸鈉(Na-Citrate-2H₂O)2～3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L、質量分數20％葡萄糖(Glucose)24～26mL/L、質量分數1％酵母提取物(Yeast extract)90～110mL/L、L-亮氨酸(L-Leucine)45～55mg/L、L-甲硫氨酸(L-Methionine)45～55mg/L、質量分數0.2％酪蛋白水解物(Casamino acid)90～110mL/L；