[發明專利]一種細胞松弛素類化合物的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201911224166.0
• 申請日: 2019-12-02
• 公開（公告）號: CN110863021B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 楊瑞云;覃玉月;莫土香;徐照隆;李俊
• 申請（專利權）人: 廣西師范大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/10;A61K31/4035;A61P31/04;C12R1/645
• 代理公司: 南寧新途專利代理事務所(普通合伙) 45119
• 代理人: 但玉梅

1.一種細胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于：所述細胞松弛素類化合物為細胞松弛素C和細胞松弛素D，是通過廣豆根內生真菌炭角菌GDGJ-368發酵得到，所述炭角菌GDGJ-368的保藏號為CCTCC?M2019951；所述細胞松弛素類化合物是通過將炭角菌GDGJ-368接種在大米培養基中發酵，將發酵液通過硅膠柱層析分離得到的；具體包括以下步驟：

(1)配制種子培養基，將所述炭角菌GDGJ-368接種到PDA平板培養基，培養后得到種子培養基；

(2)將步驟(1)得到的種子培養基切割后接種至滅菌后的大米培養基中發酵，發酵培養得發酵物，而后將發酵物用有機溶劑浸泡提取，減壓濃縮之后得到粗浸膏；

(3)步驟(2)得到的粗浸膏經過硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯進行梯度洗脫，所述石油醚-乙酸乙酯梯度范圍為：10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10；合并7:3和5:5梯度洗脫得到的餾分，濃縮后經反相C18柱層析、Sephadex?LH-20凝膠柱層析，再進行重結晶，即得到細胞松弛素C和細胞松弛素D。

2.根據權利要求1所述一種細胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于：所述PDA平板培養基主要由以下原料制成：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉15～20g/L；培養條件為28℃恒溫培養4-6天。

3.根據權利要求1所述一種細胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于：步驟(2)中所述的發酵條件為，在每個大米培養基中接種一塊蠶豆大小的菌體，室溫條件下靜置培養25-50天；所述大米培養基中所含的組分包括：大米50-90g，蒸餾水120-150mL。

4.根據權利要求1所述一種細胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于：步驟(2)中所述的發酵物為固體，所述有機溶劑為乙酸乙酯，提取次數為1-5次，將每次的提取液合并后減壓濃縮得到粗浸膏。

5.根據權利要求1所述一種細胞松弛素類化合物的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中，具體步驟還包括，合并7:3和5:5梯度洗脫得到的餾分后，濃縮至干得固體B；

將固體B拌樣過硅膠柱，使用石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑以體積比為9:1、7:3、5:5、3:7、0:10梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯體積比7:3洗脫的部分，濃縮后，得到固體C；收集石油醚-乙酸乙酯體積比5:5洗脫的部分，濃縮后，得到固體D；

固體C使用反相C18柱純化，用體積比7:3的甲醇-水洗脫并收集洗脫物，使用甲醇重結晶得到細胞松弛素C；

固體D使用反相C18柱純化，用體積比7:3的甲醇-水洗脫并收集洗脫物，濃縮后通過凝膠色譜柱Sephadex?LH-20純化，洗脫劑為體積比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，得到細胞松弛素D。