[發明專利]PQQ-sGDH突變體、聚核苷酸及其在葡萄糖檢測中的應用

在審

• 申請號: 201911223979.8
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN111073866A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 王哲;畢鑫;邱日永
• 申請（專利權）人: 英科隆生物技術（杭州）有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12Q1/54;C12Q1/32
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

本發明提供PQQ?sGDH突變體、聚核苷酸及其在葡萄糖檢測中的應用。具體的涉及一種可溶性吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(PQQ?sGDH)突變體，其氨基酸位置對應于醋酸鈣不動桿菌的野生型PQQ?sGDH序列SEQ ID NO 1，所述PQQ?sGDH突變體攜帶的突變包括以下一組突變中的一種：A194F、基于A194F的組合突變、基于Q192A的組合突變或基于Q192S的組合突變。這些PQQ?sGDH突變體具有良好的葡萄糖底物特異性，對麥芽糖等糖的交叉反應性顯著下降，適合用于對血液等樣品中的葡萄糖進行光化學或電化學檢測，也適合用于生化檢測項目中對血液等樣品中的葡萄糖進行干化學或濕化學檢測，此外也可用于間接檢測血液等樣品中的核酸等分子。

技術領域

本發明涉及可溶性吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(PQQ-sGDH)突變體，具體而言就是以醋酸鈣不動桿菌野生型PQQ-sGDH編碼基因或其編碼蛋白同源性在90％以上的DNA作為模板，利用PCR擴增進行定點突變，獲得一系列具有良好的葡萄糖底物特異性和/或熱穩定性且對麥芽糖的交叉反應性顯著降低的PQQ-sGDH突變體。同時還提供編碼所述PQQ-sGDH突變體的聚核苷酸、包含所述聚核苷酸的表達載體、包含所述表達載體的轉化細胞以及利用所述PQQ-sGDH突變體檢測樣品中葡萄的方法、試劑和裝置。

背景技術

血糖濃度是糖尿病的一個非常重要的標志物。血糖濃度的測定在糖尿病的臨床診斷和管理中極為重要。血糖的檢測通常涉及酶催化下的葡萄糖氧化。根據酶的類型不同，可分為葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脫氫酶(GDH)。在利用試紙條和血糖儀檢測血糖時，GOD雖然具有較高的特異性，也不受到葡萄糖之外的糖類物質的干擾，但是極易受到血液中氧氣的干擾而導致測定結果不準確。而GDH則不受到血液中氧氣的干擾，因而得到廣泛應用。

對GDH而言，根據其輔酶的不同，它大致可分為吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(PQQ-GDH)，黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶(NAD-GDH)。作為GDH中的一種，PQQ-GDH使用吡咯喹啉醌(PQQ)作為輔酶。

PQQ-GDH的EC編號早前為EC 1.1.99.17，后被更改為EC 1.1.5.2。目前科學家們已在細菌中發現兩類PQQ-GDH(EC 1.1.5.2)：第一種為膜結合的PQQ-GDH(PQQ-mGDH)；第二種是可溶性的PQQ-GDH(PQQ-sGDH)。這兩種PQQ-GDH的生化性質差異較大。PQQ-sGDH只在不動桿菌屬細菌的周質空間(periplasmic space)中發現，如醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoacelicus)和鮑曼氏不動桿菌(A.baumannii)，以下以醋酸鈣不動桿菌為例進行說明。

醋酸鈣不動桿菌同時含有上述兩種不同的PQQ-GDH，其中，PQQ-mGDH只在細菌細胞內是有活性的，而PQQ-sGDH只在細菌細胞外表現出活性。此外，它們的序列并不存在顯著的同源性。PQQ-sGDH是由兩個相同的亞基組成的，每個亞基含有3個鈣離子，每個亞基的分子量為50kD，每個亞基的N端是一個由24個氨基酸殘基組成的信號肽，在分泌到周質空間中后被切除。PQQ-sGDH可以催化多種單糖和二糖氧化成相應的酮，酮再進一步水解成醛糖酸，并且，該酶可以將氧化反應時產生的電子提供給吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2,6-二氯靛酚(DCIP)、沃斯特藍(Wurster’s blue)以及短鏈泛醌分子如泛醌Q1和泛醌Q2以及某些人工電子受體，如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯(N-methylphenazonium methyl sulfate)，以及導電聚合物等。相比于PQQ-mGDH，PQQ-sGDH具有良好的水溶性和較廣的電子受體特異性，因此，它非常適合用于試紙條或血糖儀的葡萄糖測定之中。