[發(fā)明專利]監(jiān)測細胞自噬的溶酶體靶向pH熒光探針及制備和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911220723.1
• 申請日: 2019-12-03
• 公開（公告）號: CN110951483A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王曉東;樊麗;董川;雙少敏
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D491/107;G01N21/64
• 代理公司: 太原申立德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發(fā)明涉及pH熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及監(jiān)測細胞自噬的溶酶體靶向pH熒光探針及制備和應(yīng)用。其制備方法是：將2?(2?氨基乙基)?3'，6'?雙(二乙氨基)螺環(huán)[異吲哚?1,9'?黃原]?3?酮和2?(2?甲氧基乙氧基)4?甲基苯磺酸乙酯溶于N,N?二甲基甲酰胺中，加熱回流制得粗品；將粗品除去溶劑，經(jīng)硅膠柱分離得到純品。通過細胞毒性測試表明本發(fā)明對細胞幾乎沒有毒副作用，進而通過細胞共定位實驗確定該探針能夠?qū)Ｒ恍园邢蚣毎苊阁w，激光共聚焦顯微成像實驗表明本發(fā)明的探針具有良好的細胞膜滲透性，并能對溶酶體內(nèi)pH的變化進行高靈敏檢測。本發(fā)明的探針可以通過檢測溶酶體內(nèi)pH的變化來監(jiān)測細胞的自噬過程。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及pH熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及監(jiān)測細胞自噬的溶酶體靶向pH熒光探針及制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的，是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。細胞自噬作為生物體中一種非常重要的代謝途徑，是細胞成分降解和回收利用的基礎(chǔ)，在細胞中起著“清道夫”的作用。傳統(tǒng)的自噬監(jiān)測策略是基于掃描電子顯微鏡(TEM)，通過蛋白免疫印跡(Atg8/LC3)或基因編碼的熒光蛋白法(GFP-LC3/p62)監(jiān)測自噬體相關(guān)蛋白。然而，這些方法通常具有局限性，如掃描電鏡和蛋白免疫印跡法通常需要進行細胞固定以使細胞易于獲得抗體，即無法監(jiān)測活細胞自噬狀態(tài)；同時，熒光蛋白法需要復(fù)雜的設(shè)計和轉(zhuǎn)染過程，不允許長時間的自噬監(jiān)測，再加上GFP-LC3容易在酸性自噬溶酶體中的降解以及GFP的熒光猝滅等，通過上述方法很難實現(xiàn)對活細胞自噬的快速、實時、低成本的監(jiān)測。因此以一種高效和經(jīng)濟的方式來觀察自噬仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

溶酶體是真核細胞中一種具有單層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，內(nèi)含許多水解酶，用來分解多種外源性和內(nèi)源性生物大分子物質(zhì)或細胞自身的局部細胞質(zhì)或細胞器等。一般來說，自噬發(fā)生時，自噬體的膜會和溶酶體的膜進行融合形成自噬溶酶體，使內(nèi)容物在酸性pH值(4.5～5.5)的水解酶的幫助下降解和再循環(huán)。在自噬的膜融合過程中，由于溶酶體和自噬體的差異，溶酶體pH值等微環(huán)境會發(fā)生變化。因此，我們可以通過檢測溶酶體內(nèi)pH的變化來監(jiān)測自噬進行的程度。

目前文獻報道了許多檢測溶酶體pH變化的熒光探針，然而由于這些探針的激發(fā)和發(fā)射波長大多處于紫外區(qū)域，與細胞自發(fā)熒光相互交疊，造成背景熒光較強，且紫外光對細胞的毒副作用較大，因而不適合長時間的檢測。此外，現(xiàn)有溶酶體靶向基團集中于傳統(tǒng)的嗎啉環(huán)和二甲氨基結(jié)構(gòu)，這類弱堿性基團容易聚集在弱酸性溶酶體中引起溶酶體的“堿化效應(yīng)”，長時間作用會導(dǎo)致細胞中毒。因此，需要開發(fā)新型的溶酶體靶向探針用于溶酶體內(nèi)pH的檢測。本發(fā)明引入能夠有效避免溶酶體的“堿化效應(yīng)”的二乙二醇單甲醚為新型溶酶體靶向基團，利用具有優(yōu)良pH響應(yīng)熒光性質(zhì)的羅丹明B為熒光團母體結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成了新型pH熒光探針RML，通過對細胞溶酶體內(nèi)pH的特異性檢測實現(xiàn)對細胞自噬過程的監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種溶酶體靶向pH熒光探針RML的制備方法；目的之二是提供該熒光探針的用途，即用于制備動物細胞自噬過程中溶酶體內(nèi)pH的檢測試劑。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

一種監(jiān)測細胞自噬的溶酶體靶向pH熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

一種監(jiān)測細胞自噬的溶酶體靶向pH熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)將2-(2-氨基乙基)-3'，6'-雙(二乙氨基)螺環(huán)[異吲哚-1,9'-黃原]-3-酮和2-(2-甲氧基乙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加熱回流反應(yīng)，體系冷卻至室溫，減壓旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺溶劑制得粗品；