[發(fā)明專利]一種克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201911183645.2
• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110819644A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮春杰;王崇鞠
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群的方法。本發(fā)明的克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群的方法，包括步驟：1)選取細菌一；2)擴增細菌一的部分法尼基轉(zhuǎn)移酶基因引物采用第一簡并引物，模板為細菌一的基因組；3)將擴增得到的部分法尼基轉(zhuǎn)移酶基因做比對，獲得親緣關(guān)系最近的菌種并獲得其的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶的基因序列；4)根據(jù)親緣關(guān)系最近菌種的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因序列設(shè)計第二簡并引物，擴增細菌一的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，模板為細菌一的基因組；5)按照該方法依次得到多個細菌的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，建構(gòu)法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群。本發(fā)明的方法能夠獲取大量的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群的方法。

背景技術(shù)

法尼基轉(zhuǎn)移酶是他汀類藥物生產(chǎn)的重要催化劑，獲取法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員能為法尼基轉(zhuǎn)移酶基因研究和他汀類藥物生產(chǎn)提供豐富的候選基因資源。目前，克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員的方法是首先在基因庫中確定法尼基轉(zhuǎn)移酶基因序列，然后根據(jù)法尼基轉(zhuǎn)移酶基因序列設(shè)計引物克隆已知菌種的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因；這種方法獲取的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因十分有限，僅局限于基因庫中已公開的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，不能獲取未公開在基因庫中法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，這種方法不能全面獲取法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群的方法，能夠獲取大量的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員，為法尼基轉(zhuǎn)移酶基因研究和他汀類藥物生產(chǎn)提供豐富的候選基因資源。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的克隆法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員的方法，包括步驟：

(1)選取細菌一；

(2)利用PCR技術(shù)擴增細菌一的部分法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，PCR 擴增技術(shù)中引物采用第一簡并引物，第一簡并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，模板為細菌一的基因組DNA；

(3)將擴增得到的部分法尼基轉(zhuǎn)移酶基因做BLAST比對，獲得親緣關(guān)系最近的菌種并獲得親緣關(guān)系最近菌種的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶的基因序列；

(4)根據(jù)步驟(3)親緣關(guān)系最近菌種的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因序列設(shè)計第二簡并引物，利用PCR技術(shù)擴增細菌一的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，該步驟的PCR擴增技術(shù)中引物為第二簡并引物，模板為細菌一的基因組DNA；

(5)再選取細菌二，按照上述步驟(2)至步驟(4)的方法獲取細菌二的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，按照該方法依次得到多個細菌的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，建構(gòu)法尼基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員群。

作為優(yōu)選方案，所述步驟2)和步驟4)中PCR擴增體系為10× PCR反應(yīng)緩沖液5μl、25mmol/L Mgso4 2μl、10mmol dNTP 5μl、 10nmol/L引物各1μl、模板80ng、KoD-Plus DNA聚合酶1μl、雙蒸去離子水定容至50μl；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，55℃ 30s，68℃延伸1.30min，共計30個循環(huán)；68℃延伸10min；15℃保持10min。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明利用第一簡并引物克隆出細菌一法尼基轉(zhuǎn)移酶基因的部分堿基序列，將擴增得到的部分法尼基轉(zhuǎn)移酶基因做BLAST比對獲得親緣關(guān)系最近的菌種并確定親緣關(guān)系最近菌種的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因的序列，根據(jù)該法尼基轉(zhuǎn)移酶基因的序列設(shè)計第二簡并引物，利用第二簡并引物和基因組DNA，擴增得到細菌一的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因基因。采用這種方法能得到大量的完整法尼基轉(zhuǎn)移酶基因序列，相比于基因庫中的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，本發(fā)明能得到基因庫中未公開的法尼基轉(zhuǎn)移酶基因，顯著增加了法尼基轉(zhuǎn)移酶基因的種類，為法尼基轉(zhuǎn)移酶研究和他汀類藥物生產(chǎn)提供豐富的候選基因資源。

附圖說明