[發(fā)明專利]一種蛋白質(zhì)水解度測定方法

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• 申請日: 2019-11-27
• 公開（公告）號: CN110836936A
• 公開（公告）日: 2020-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王靜;楊桂蘭;耿鳳;郭文逸;王欣;郭學(xué)平;劉愛華
• 申請（專利權(quán)）人: 華熙生物科技股份有限公司;山東華熙海御生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 濟南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 安麗艷

1.一種蛋白質(zhì)水解度的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將水解后的蛋白質(zhì)溶液用緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度的蛋白水解液；

（2）將蛋白水解液以高效凝膠過濾色譜法測定多肽分子量分布，計算不同分子量范圍多肽的質(zhì)量百分含量X_a，其中，a為相對分子量；

（3）結(jié)果與計算：

（a）樣品中的多肽含量，按照下式計算：

多肽含量（%）= ΣX_a，

其中，a = 200Da-10000 Da；

（b）樣品中游離氨基酸的含量，按照下式計算：

游離氨基酸含量（%）= X_a，

其中，a < 200 Da；

（c）蛋白水解度，按照下式計算：

蛋白水解度（%）= Σ（128X_a/a’），

其中，128為氨基酸平均分子量，

a’為不同分子量范圍多肽的平均分子量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（1）中，蛋白水解液的濃度為20-200mg蛋白/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（1）中，所述緩沖液的pH為6.5-8.0；所述緩沖液的濃度為20-50mmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定方法，其特征在于，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖溶液，磷酸緩沖溶液，Britton-Robinson廣泛緩沖溶液，Clark-Lubs緩沖溶液，Tris-HCl緩沖溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（2）中，所述高效凝膠過濾色譜法的色譜條件如下：

色譜柱：Superdex peptide 10/300 GL；

流動相：0.10-0.20M NaCl、20-50mM pH 7.2磷酸鹽緩沖液；

流速：0.2-1.0mL/min；

檢測波長：214nm；

壓力：不超過1.8Mpa；

進樣體積：20-100μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算準(zhǔn)確多肽含量、游離氨基酸含量和蛋白質(zhì)水解度的步驟：

（i）將一系列不同水解程度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按照步驟（1）-（3）的方法分別測定游離氨基酸含量、多肽含量和蛋白質(zhì)水解度；

（ii）將（i）中的一系列不同水解程度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液測定游離氨基酸和多肽的準(zhǔn)確含量及準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)水解度；

（iii）以（i）中游離氨基酸含量為縱坐標(biāo)，以柱前衍生高效液相色譜法測定的游離氨基酸準(zhǔn)確含量為橫坐標(biāo)做游離氨基酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

以（i）中多肽含量為縱坐標(biāo)，以三氯乙酸沉淀法的多肽準(zhǔn)確含量為橫坐標(biāo)做多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

以（i）中蛋白質(zhì)水解度為縱坐標(biāo)，以茚三酮比色法測定的準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)水解度為橫坐標(biāo)做蛋白質(zhì)水解度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（iv）將測定獲得的蛋白水解液的游離氨基酸含量、多肽含量和蛋白質(zhì)水解度分別代入（iii）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得準(zhǔn)確的游離氨基酸含量、多肽含量和蛋白質(zhì)水解度。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定方法，其特征在于，步驟（ii）和（iii）中，所述游離氨基酸含量測定方法選自紙層析法或柱前衍生高效液相色譜法；

所述多肽含量測定方法選自雙縮脲法、鄰苯二甲醛法、紫外吸收法或三氯乙酸法；

所述蛋白質(zhì)水解度選自pH-state法、三硝基苯磺酸法、甲醛滴定法或茚三酮比色法。