[發明專利]一種酶法制備亞精胺的方法

有效

• 申請號: 201911171620.0
• 申請日: 2019-11-26
• 公開（公告）號: CN111019960B
• 公開（公告）日: 2023-10-10
• 發明（設計）人: 陳可泉;劉逸;王昕;郭興;喬榮梅;高思遠;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P13/00
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種酶法制備亞精胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，構建質粒pcwj-speD和質粒petduet-speE

（1）構建質粒pcwj-speD：

設置上游引物帶有EcoR I酶切位點，序列1為CCGGAATTCTTGAAAAAACTGAAACTGCATGGC，

設置下游引物帶有BamH I酶切位點，序列2為CGCGGATCCTTAAACAGCTGGCATATTGCGC，

大腸桿菌KA30的基因組DNA作為模板擴增得到片段speD,將保在DH5α中的pcwj質粒進行提取，選取酶切位點EcoR I和 BamH I，將片段和質粒都進行雙酶切操作，酶切完成后，分別進行膠回收，完成后檢測質粒濃度；使用T4 DNA Ligase(Takara)將膠回收之后的質粒和片段進行連接后，轉化感受態,涂板于帶有氯霉抗性的平板上隔夜培養，待平板上長出單菌落后使用質粒通用引物進行菌落PCR驗證，同時劃線于相同抗性的平板上培養8-12h，經核酸凝膠電泳驗證后挑選正確的陽性結果進行提質粒并經公司測序，確認插入序列無誤即為成功構建質粒pcwj-speD；

（2）構建質粒petduet-speE

設置上游引物帶有BamH I酶切位點，序列3為CGCGGATCCAATGGCCGAAAAAAAACAGTGG，

設置下游引物帶有Sal I酶切位點，序列4為ACGCGTCGACTTAGGACGGCTGTGAAGC，

大腸桿菌KA30的基因組DNA作為模板擴增得到片段speD，將保在DH5α中的pcwj質粒進行提取，選取酶切位點BamH I和 Sal I，將片段和質粒都進行雙酶切操作，酶切完成后分別進行膠回收，完成后檢測下質粒濃度，使用T4 DNA Ligase(Takara)將膠回收之后的質粒和片段進行連接后，轉化感受態,涂板于帶有氨芐抗性的平板上隔夜培養，待平板上長出單菌落后使用質粒通用引物進行菌落PCR驗證，同時劃線于相同抗性的平板上培養12-16h，經核酸凝膠電泳驗證后挑選正確的陽性結果進行提質粒并經公司測序，確認插入序列無誤即為成功構建質粒petduet-speE；

步驟2，菌株的誘導表達

（1）將驗證構建成功的質粒分別轉化到大腸桿菌BL21DE3中，涂布于對應抗性的平板上；

（2）菌體的誘導表達：將菌株BL21DE3-pcwj-speD,BL21DE3-petduet-speE分別接種至5mlLB液體培養基，千分之2的抗性，37℃，200rpm條件下培養至OD≈0.8，按百分之一的接種量接至100mL LB液體培養基，2‰抗性，37℃，200rpm條件下培養至OD≈0.6-0.8之間進行誘導，誘導劑用量為度0.5‰~2‰；

步驟3，催化生產亞精胺

在50ml反應小瓶中進行如下體系：稱取100mg S-腺苷甲硫氨酸，100mg丁二胺鹽酸鹽，加入適量Mg²⁺和PLP后加入10mlPBS緩沖液，另外加入5-20ml BL21DE3-pcwj-speD粗酶液，1-5ml BL21DE3-petduet-speE粗酶液，使用pH計將pH調至6.5-8，反應10-16h，完成催化反應，檢測反應液上清中S-腺苷甲硫氨酸的消耗以及亞精胺的生成情況。

2.根據權利要求1所述的一種酶法制備亞精胺的方法，其特征在于，步驟1中擴增時的PCR體系為95℃ 2-5min ，95℃ 10-20s，55℃ 10-20s，72℃ 10-20s，共30個循環；72℃ 5-10min。

3.根據權利要求1所述的一種酶法制備亞精胺的方法，其特征在于，步驟1中酶切時的體系30-37℃，1-2h。

4.根據權利要求1所述的一種酶法制備亞精胺的方法，其特征在于，步驟1中將膠回收之后的質粒和片段進行連接的體系為10×Ligase buffer1-2ul，T4 DNA Ligase(Takara)1μl，基因片段5-7ul，載體1-2ul。

5.根據權利要求1所述的一種酶法制備亞精胺的方法，其特征在于，步驟1中感受態為Trans1-T1或DH5α。