[發(fā)明專利]一種用于規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株及其建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911157555.6
• 申請(qǐng)日: 2019-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111117944B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武發(fā)菊;尚勇良;安芳蘭;葛玉鳳;陶世宇;劉強(qiáng);張春祥;劉學(xué)榮;龍玉紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中農(nóng)威特生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株及其建立方法。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因Bcl?2通過(guò)真核表達(dá)載體導(dǎo)入MDCK細(xì)胞，建立了Bcl?2過(guò)表達(dá)的MDCK抗凋亡宿主細(xì)胞株，將改造的MDCK細(xì)胞株使用低血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，72h時(shí)活細(xì)胞密度達(dá)4.5×10⁶cells/ml，細(xì)胞活率95％以上，較正常組細(xì)胞表達(dá)量提高了31％；同時(shí)跟蹤Bcl?2基因過(guò)表達(dá)的MDCK細(xì)胞株培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示較正常組細(xì)胞，改造后的MDCK細(xì)胞的凋亡率顯著降低，活力顯著提高。本發(fā)明的提出為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的疫苗產(chǎn)品提供了高質(zhì)量的宿主細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株及其建立方法，特別涉及一種抗凋亡基因Bcl-2過(guò)表達(dá)的MDCK細(xì)胞株及其建立方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自20世紀(jì)至今，全球流感多次發(fā)生，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的健康，給全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。故利用疫苗免疫進(jìn)行流感病毒疾病預(yù)防顯得至關(guān)重要。目前的流感疫苗主要是以雞胚為介質(zhì)制備的滅活疫苗，但是這種疫苗存在外源因子易污染、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、操作步驟繁瑣、疫苗批次間差異大、雞胚連續(xù)傳代病毒時(shí)易發(fā)生抗原變異且難以大量供應(yīng)等缺陷。隨著國(guó)內(nèi)外大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟和應(yīng)用，以細(xì)胞為介質(zhì)的流感病毒疫苗的制備已是必然趨勢(shì)，其中MDCK細(xì)胞為首選細(xì)胞系。

單細(xì)胞MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不受細(xì)胞生長(zhǎng)表面基質(zhì)的限制，易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。然而懸浮馴化的MDCK細(xì)胞經(jīng)逐級(jí)放大培養(yǎng)后，由于血清的缺乏、有害代謝產(chǎn)物如氨和乳酸的積累、氧自由基或溶氧過(guò)低、酸性pH環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)缺乏等多種因素的影響，容易誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生死亡，而在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中死亡細(xì)胞的80％是凋亡所致，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡成為影響活細(xì)胞密度和目的產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素，因此維持細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生成為眾多研究者提高細(xì)胞質(zhì)量、改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究的熱點(diǎn)。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)MDCK細(xì)胞代謝流控制策略的研究，考察了MDCK細(xì)胞代謝流特征和增殖能力，馴化適應(yīng)的MDCK細(xì)胞，應(yīng)用基因工程原理，結(jié)合MDCK懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)特性，在Bcl-2基因前使用優(yōu)化的Kozak序列等方法對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化，將基因克隆整合至載體中后，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)Bcl-2基因在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)；將改造的抗凋亡細(xì)胞株初步應(yīng)用于MDCK細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)工藝中，降低了培養(yǎng)過(guò)程中MDCK細(xì)胞的凋亡率，提高了其活力，建立了抗凋亡MDCK細(xì)胞種子庫(kù)，從而為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株及其建立方法，實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中低凋亡率、高活率的增殖。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因Bcl-2通過(guò)真核表達(dá)載體導(dǎo)入MDCK細(xì)胞，建立了Bcl-2過(guò)表達(dá)的MDCK-B抗凋亡宿主細(xì)胞株，將改造的MDCK細(xì)胞株低血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，72h時(shí)活細(xì)胞密度達(dá)4.5×10⁶cells/ml，細(xì)胞活率95％以上，較正常組細(xì)胞表達(dá)量提高了31％；同時(shí)跟蹤Bcl-2基因過(guò)表達(dá)的MDCK細(xì)胞株培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示較正常組細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡率顯著降低，活力顯著提高。

本發(fā)明獲得的一種用于規(guī)模化懸浮培養(yǎng)的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株，命名為狗腎細(xì)胞MDCK-B，分類命名為狗腎細(xì)胞MDCK-B，該細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO:C2019142，保藏時(shí)間為2019年7月17日。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗凋亡MDCK宿主細(xì)胞株在病毒生產(chǎn)中的應(yīng)用。

其中，優(yōu)選的，所述的病毒是用于制備疫苗。

其中，優(yōu)選的，所述的疫苗為流感病毒疫苗。