[發明專利]一種前導肽突變體及其在角蛋白酶生產中的應用

有效

• 申請號: 201911153529.6
• 申請日: 2019-11-22
• 公開（公告）號: CN110846299B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 張娟;彭政;陳堅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/57;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種前導肽突變體及其在角蛋白酶生產中的應用，屬于酶工程和微生物工程技術領域。本發明通過將角蛋白酶的前導肽進行突變大大提高了角蛋白酶的產量；將本發明的以由編碼信號肽的基因、編碼前導肽突變體的基因以及編碼角蛋白酶的基因依次串聯而得的DNA片段為目的基因，以pP43NMK質粒為表達載體，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600為表達宿主構建得到的可高產角蛋白酶的枯草芽孢桿菌工程菌進行發酵，發酵24h，即可使得發酵上清液中的酶活高達109290～157080U/mL。

技術領域

本發明涉及一種前導肽突變體及其在角蛋白酶生產中的應用，屬于酶工程和微生物工程技術領域。

背景技術

角蛋白酶是一種能夠降解不可溶的硬質蛋白--角蛋白類底物（例如羽毛、羊毛、頭發、皮屑等）的特異性蛋白酶，其主要由細菌、真菌、放線菌等微生物在以角蛋白為單一碳氮源時生長分泌獲得。

作為一種底物專一性較寬泛，水解催化能力強的蛋白酶，角蛋白酶可以替代傳統蛋白酶，廣泛應用于羽毛降解、皮革紡織、飼料添加劑、有機化肥和洗滌劑等領域，具有巨大的市場。

但是，野生角蛋白酶的性能拙劣、產量低下，遠遠不能滿足市場需求，因此，它很難被真正應用于工業化生產中。

現在，常常采用構建基因工程菌的手段，強化角蛋白酶基因的轉錄和翻譯，以達到提高角蛋白酶產量的目的，例如，Porres J M等人以來源于B. licheniformis MKU3的編碼角蛋白酶基因為目的基因、以pPICZαA為載體、以Pichia pastoris X33為宿主構建得到了一株可產角蛋白酶的基因工程菌，將此基因工程菌發酵24 h，僅可使發酵上清液中的酶活達到285 U/L（具體可見參考文獻：Porres J M, Benito M J, Lei X G. Functionalexpression of keratinase (kerA) gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris. Biotechnology Letters[J], 2002, 24(8): 631-636.）；Fang等人以來源于Stenotrophomonas maltophilia的編碼角蛋白酶基因為目的基因、以pET22b為載體、以大腸桿菌DE3為宿主構建得到了一株可產角蛋白酶的基因工程菌，將此基因工程菌發酵72 h，僅可使發酵上清液中的酶活達到712 U/L（具體可見參考文獻：Zhen Fang, Juan Zhang,Baihong Liu, Linghuo Jiang, Guocheng Du, Jian Chen. Cloning, heterologousexpression and characterization of two keratinases from Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1. Process Biochemistry. 2014, 49.4: 647-654.）。但是，上述產量仍舊未能達到工業化生產的水平。

因此，急需找到一種提高角蛋白酶產量的方法以滿足工業化生產的要求。

發明內容

[技術問題]

本發明要解決的技術問題是提供一種產量高的生產角蛋白酶的方法。

[技術方案]

為解決上述技術問題，本發明提供了一種前導肽突變體，所述前導肽突變體是通過將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的前導肽的第76位亮氨酸、第39位天冬氨酸、第17位絲氨酸、第18位甘氨酸、第37位天冬氨酸、第48位丙氨酸或第57位谷氨酸進行突變得到的。