[發(fā)明專利]快速鑒別培養(yǎng)基及其在纖維素酶定性檢測中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911147647.6
• 申請日: 2019-11-21
• 公開（公告）號: CN110734954A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭翔;秦夢;秦艷梅;馬清河
• 申請（專利權(quán)）人: 河北省微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 13101 石家莊海天知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 田文其

本發(fā)明屬于纖維素酶的檢測，特別是指快速鑒別培養(yǎng)基及其在纖維素酶定性檢測中的應(yīng)用。公開了一種以羥甲基纖維素鈉為主要成分的快速鑒別培養(yǎng)基以及在纖維素酶定性檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明解決了目前纖維素酶定性檢測中存在的時(shí)間長、要求高等問題，具有檢測時(shí)間短、培養(yǎng)基成份簡單、對樣品顏色沒有要求等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于纖維素酶的檢測，特別是指快速鑒別培養(yǎng)基及其在纖維素酶定性檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

纖維素酶(Cellulases)是指在各種酶組分的協(xié)同作用下降解纖維素，使之轉(zhuǎn)化為還原糖類的酶，包括外切β-1，4-葡聚糖苷酶(Exoβ-1，4-gluca Nase，EC 3.2.1.91)、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖苷酶(Endoβ-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucos idase，EC 3.2.1.21)。不同來源的纖維素酶中以上三種組分的比例不同。

中華人民共和國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《纖維素酶制劑》(QB 2583-2003)公布了纖維素酶的測定方法：一是濾紙酶活力(FPA)的測定方法；二是羥甲基纖維素(還原糖法)酶活力(CMCA-DNS)測定方法；三是羥甲基纖維素(粘度法)酶活力(CMCA-VIS)測定方法。其中前兩種是通過測定底物生成的還原糖來反映纖維素酶的總酶活力；而第三種是通過測定底物的粘度與標(biāo)準(zhǔn)酶對照得到纖維素酶的相對酶活力。

酶制劑樣品定量檢測時(shí)對待測樣品的酶活力有范圍要求，如QB 2583-2003 中濾紙酶活力的測定方法要求試樣與空白液吸光度的差值在0.3-0.4范圍內(nèi)；羥甲基纖維素酶活力測定方法要求吸光度差值在0.33-0.35范圍內(nèi)。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)對一些未知酶活力的樣品，需要先評價(jià)其是否含有纖維素酶，然后檢測樣品中纖維素酶活力的具體指標(biāo)。

目前在酶活力測定時(shí)通常將未知的酶制劑樣品稀釋不同的倍數(shù)，然后依據(jù)QB2583-2003檢測不同稀釋倍數(shù)樣品的具體活力指標(biāo)，每個(gè)稀釋倍數(shù)的樣品要有三個(gè)重復(fù)。上述方法需要進(jìn)行大量試劑的配制并進(jìn)行酶催化反應(yīng)和比色過程，且某些試劑的保質(zhì)期較短；同時(shí)對于顏色較深的低酶活力的樣品無法用比色法檢測是否有纖維素酶活力。因此QB2583-2003方法對于定性評價(jià)是否含有纖維素酶來說費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，如果有能夠快速鑒別樣品是否含有纖維素酶的方法，為精確定量測量提供輔助，有利于提高實(shí)際生產(chǎn)的效率。

沈萍主編的《微生物學(xué)》2000版中提到用平皿透明圈法篩選產(chǎn)酶微生物菌株是微生物篩選工作中比較常用的手段之一。而目前報(bào)道的有通過平皿透明圈的方法篩選產(chǎn)纖維素酶菌株的方法，比如黃勝威在《暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物分子多態(tài)性及纖維素降解菌多樣性的研究中》用初篩培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行篩選，將挑選得到的純培養(yǎng)菌株接種到羥甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)的第3天、第5天和第7天時(shí)分別取出，進(jìn)行剛果紅染色。測量其分解圈直徑(D)和菌落直徑(d)，并計(jì)算每個(gè)菌株的D/d值，根據(jù)值的大小確定菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱。申請?zhí)枮?01310004456.0的發(fā)明專利申請中公開了一種彩色生物纖維素在纖維素酶產(chǎn)生菌活性快速檢測中的應(yīng)用，是利用彩色生物纖維素凝膠在纖維素酶產(chǎn)生菌活性快速檢測中的應(yīng)用，以彩色的生物纖維素凝膠作為底物與纖維素酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)液反應(yīng)，反應(yīng)完成后直接觀測溶液的顏色，而不使用DNS試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。申請?zhí)枮?201810032356.1的發(fā)明專利申請中公開了一種同時(shí)篩選蛋白酶和纖維素酶的培養(yǎng)基及方法，采用同時(shí)添加蛋白酶底物明膠蛋白和纖維素酶底物羧甲基纖維素的方式，制備培養(yǎng)基：1-3g NaNO₃；0.8-1.2g K₂HPO₄；0.4-0.6g MgSO₄； 0.4-0.6g KCl；1-3g羧甲基纖維素或微晶纖維素；8-12g明膠；1-3g酵母浸粉；16-18g瓊脂或瓊脂糖；加水定容至1000ml。結(jié)合先碘熏后考馬斯亮藍(lán)染色的方法，建立同時(shí)檢測和篩選纖維素酶和蛋白酶活性菌株的快捷方法。但以上三種方法初衷是鑒別產(chǎn)酶微生物或者發(fā)酵液中纖維素酶情況，需要進(jìn)行長時(shí)間的微生物培養(yǎng)或者酶催化反應(yīng)，同時(shí)鑒別培養(yǎng)基成分復(fù)雜，對纖維素酶有顏色要求。