[發(fā)明專利]一種野生稻莖尖的超低溫保存方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911146883.6
• 申請日: 2019-11-21
• 公開（公告）號: CN110800734A
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林田;阿新祥;李天菲;聶元元;韓靜;董超;周莉;騰小英;楊華;劉鴻艷;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 上海智力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

本發(fā)明涉及一種疣粒野生稻帶根幼芽超低溫保存及再生植株方法，具體的說，涉及一種疣粒野生稻帶根幼芽的超低溫保存方法，屬植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，超低溫保存及再生植株的方法包括如下步驟：1.種子破休眠處理及胚性愈傷誘導(dǎo)；2.叢生芽的誘導(dǎo)；3.叢生芽的生根培養(yǎng)；4.帶根幼芽的預(yù)培養(yǎng)；5.帶根幼芽的包埋；6.帶幼根芽的裝載及玻璃化的處理；7.冷凍及解凍洗滌；8.恢復(fù)培養(yǎng)。本發(fā)明首次提出對疣粒野生稻帶根幼芽成功進(jìn)行超低溫保存，保存后野生稻恢復(fù)生長狀況良好。對野生稻及禾本科植物的超低溫保存具有很好的參考價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種疣粒野生稻的保存方法，具體的說，涉及一種疣粒野生稻帶根幼芽的超低溫保存方法，屬植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

疣粒野生稻是原產(chǎn)中國的3種野生稻之一，是水稻育種和改良的重要遺傳資源，具有極高的科學(xué)研究價值。當(dāng)前迅速惡化的環(huán)境和不利的氣候條件及人類現(xiàn)代急速擴(kuò)張的經(jīng)濟(jì)活動導(dǎo)致了野生稻生境喪失及惡化、棲息地急劇減少；此外野生稻又具有柱頭外露、異交結(jié)實(shí)率較高、種子休眠性強(qiáng)、落粒性強(qiáng)、發(fā)芽率低的生物學(xué)特性。這些因素使疣粒野生稻種面臨滅絕的危險, 對野生稻遺傳多樣性的保護(hù)刻不容緩。目前，對疣粒野生稻的保護(hù)措施主要有就地保護(hù)和遷地保護(hù)（即以種子保存的種質(zhì)厙、以種莖保存的種質(zhì)圃）。

植物組織與細(xì)胞的培養(yǎng)為植物的種質(zhì)保存開辟了新的途徑。組織培養(yǎng)物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遺傳特性。而超低溫保存（-196℃）下，植物的生物化學(xué)活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(nèi)，避免了田間保存易受自然災(zāi)害影響而導(dǎo)致種質(zhì)變異或毀滅，以及組織培養(yǎng)保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險，被認(rèn)為是植物遺傳資源長期保存的最優(yōu)選擇。

關(guān)于植物超低溫保存的研究，保存技術(shù)的多樣化與簡易化方面不斷取得進(jìn)步，能夠保存的植物物種數(shù)也在不斷地增長，但多數(shù)集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等經(jīng)濟(jì)植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存。水稻的超低溫保存自1979年Sala等首先報道水稻懸浮細(xì)胞的超低溫保存后，相關(guān)研究多集中在組織培養(yǎng)物如懸浮細(xì)胞系、愈傷組織、原生質(zhì)體及胚狀體上，關(guān)于水稻完整器官（如莖尖）凍存的報道僅見章志宏等2000年采用程序降溫法對水稻單倍體幼穗離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行超低溫保存，得到再生植株。野生稻的超低溫保存技術(shù)相關(guān)報道更少且集中于國內(nèi)，如殷曉輝等1996年等首次通過程序降溫法對疣粒愈傷組織的超低溫保藏，有效地提高了疣粒野生稻體外培養(yǎng)細(xì)胞的胚性。譚光軒等采用程序降溫法對野生稻幼穗離體培養(yǎng)誘導(dǎo)植株，直接進(jìn)行超低溫保存，避開愈傷組織階段減少遺傳變異的危險，但產(chǎn)生的綠芽一周后白化死亡。

野生稻完整器官的凍存，將是今后研究的重點(diǎn)，便由于野生稻莖尖分生組織體積小、生理狀態(tài)脆弱，保存中難以成活。林田等首次采取一系列措施，以提高莖尖的抗性，減少各步驟中的損傷，并采用液氮直投而非依賴程序降溫儀的冷凍步驟，首次建立了普通野生稻的莖尖超低溫保存體系，并于2018年獲得專利（專利號：ZL 201610131944.1），其后，通過對方法的改進(jìn)，通過田間樣本預(yù)培養(yǎng)，組培脫菌培養(yǎng)及用叢生芽作為凍存材料，克服了原專利 1.內(nèi)生菌污染嚴(yán)重。 2.莖尖剝?nèi)〔襟E技術(shù)要求高，難度大。 3.難以獲得大量整齊一致的材料的問題，有效降低了內(nèi)生菌污染率，簡化了操作流程。在此基礎(chǔ)上，又申請了藥用野生稻專利：（申請?zhí)枺?01811280227.0）。但是，與普通野生稻不同，疣粒野生稻與栽培稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是一種典型的難培養(yǎng)植物，難以在短時間內(nèi)獲得大量整齊一致的材料。此外，雖然通過切取芽來簡化操作步驟，但在切取過程中常由于操作不慎將芽的基盤切除，從而傷害附近的莖尖生長點(diǎn)，影響成活率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種疣粒野生稻帶根幼芽的超低溫保存方法及超低溫保存后的恢復(fù)培養(yǎng)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種疣粒野生稻帶根幼芽超低溫保存方法，包括如下步驟：