[發(fā)明專利]基因突變多重檢測(cè)用引物組合物及其試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911146751.3
• 申請(qǐng)日: 2019-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN112824535B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛志琪;趙雨航;李錦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 邁克生物股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12Q1/6876;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開一種基因突變多重檢測(cè)用引物組合物及其試劑盒；該引物組合物包括第二上游引物、探針、下游引物和至少兩條不同的第一上游引物；其中，第一上游引物包括上游檢測(cè)區(qū)和靶序列結(jié)合區(qū)：上游檢測(cè)區(qū)有與第二上游引物具有相同序列的(a)部分，以及與探針具有相同序列的(b)部分；靶序列結(jié)合區(qū)的3’端具有擴(kuò)增決定位點(diǎn)，該擴(kuò)增決定位點(diǎn)與突變型靶序列上的變異檢測(cè)位點(diǎn)互補(bǔ)，且其上游具有由一個(gè)或多個(gè)堿基組成的不與靶序列互補(bǔ)的錯(cuò)配區(qū)；不同的第一上游引物為靶序列結(jié)合區(qū)不同。本發(fā)明的引物組合物還包括野生型阻斷劑。使用上述引物組合物或試劑盒檢測(cè)多重基因突變，可提高檢測(cè)靈敏度、特異性，減低檢測(cè)成本；并且檢測(cè)的準(zhǔn)備度更高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基因多重突變檢測(cè)用的數(shù)字PCR引物組合物及其試劑盒。

背景技術(shù)

數(shù)字PCR(digital?PCR,dPCR)技術(shù)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，利用極限稀釋的原理將一個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)體系分配到成千上萬(wàn)份單獨(dú)的納升級(jí)微反應(yīng)器中，使得每個(gè)微反應(yīng)器中包含或不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)核酸分子(DNA靶標(biāo))，再同時(shí)進(jìn)行單分子模板PCR擴(kuò)增。不同于熒光定量PCR在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行時(shí)采集熒光的方法，數(shù)字PCR在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行獨(dú)立采集，最后通過(guò)泊松分布的原理及陽(yáng)性/陰性的反應(yīng)單元的比例得出目標(biāo)分子的原始拷貝數(shù)或濃度。

相較于熒光定量PCR，數(shù)字PCR不依靠Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)，具有靈敏度高以及精確度高的優(yōu)勢(shì)。由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷“有/無(wú)”兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，所以數(shù)字PCR反應(yīng)和結(jié)果判讀受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高。此外，數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行分配的過(guò)程可以極大程度上在局部降低與靶標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)作用的背景序列濃度。因此，由于數(shù)字PCR具有更高的靈敏度和精確度，在需要以高靈敏度對(duì)拷貝量低的差異性核酸分子進(jìn)行定量和檢測(cè)時(shí)，體現(xiàn)出相比于傳統(tǒng)的熒光定量PCR的顯著優(yōu)勢(shì)。尤其是在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變，如通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，常用于對(duì)腫瘤患者的早期篩查、用藥指導(dǎo)、預(yù)后判斷以及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)應(yīng)用中。

而現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)試劑，多采用①TaqMan探針法、②引物特異性區(qū)分法、③阻斷野生型擴(kuò)增法。其中①TaqMan探針法通常會(huì)采用分別針對(duì)突變型和野生型的競(jìng)爭(zhēng)性探針，兩種探針為類似于點(diǎn)突變檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)性探針，或者在基因野生型模板上設(shè)計(jì)一條特異性探針，在基因的其它保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條可以同時(shí)指示野生型和突變型模板的通用探針，利用兩條探針測(cè)定的濃度差值來(lái)定量突變型模板的濃度，兩種方法均需在探針的上下游設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，導(dǎo)致擴(kuò)增子較長(zhǎng)，由于ctDNA呈高度隨機(jī)的片段化分布，因此，較短的ctDNA片段可能會(huì)被漏檢，降低檢測(cè)靈敏度，同時(shí)，當(dāng)某基因突變類型眾多時(shí)，針對(duì)不同的突變類型需設(shè)計(jì)多種不同的突變型探針，費(fèi)用較高，不利于大規(guī)模的推廣使用。②引物特異性區(qū)分法是設(shè)計(jì)不同的突變型引物來(lái)特異性區(qū)分不同的突變類型，在其下游的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條探針及下游引物，在基因的其它保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條可以同時(shí)指示野生型和突變型模板的通用探針及其上下游引物，此方法仍存在擴(kuò)增子較長(zhǎng)的問題，不利于較短的ctDNA的檢測(cè)，另外對(duì)引物的特異性要求極高，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。③阻斷野生型擴(kuò)增法常采用肽核酸(PeptideNucleic?Acid，PNA)，鎖核酸(Locked?Nucleic?Acid，LNA)修飾來(lái)阻斷野生型模板的擴(kuò)增，目前，這些修飾價(jià)格高昂，不利于臨床應(yīng)用。因此需要一種靈敏度高，特異性好，成本低的引物探針設(shè)計(jì)方法來(lái)滿足臨床使用數(shù)字?PCR技術(shù)檢測(cè)的需要。