[發明專利]一種DNA甲基化多基因位點聯合檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201911146545.2
• 申請日: 2019-11-21
• 公開（公告）號: CN110923301B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 趙輝;高蕾;王雪
• 申請（專利權）人: 昂凱生命科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/682
• 代理公司: 上海巔石知識產權代理事務所(普通合伙) 31309
• 代理人: 張琤;蔣舫瑋

本發明屬于基因檢測領域，公開了一種DNA甲基化多基因位點聯合檢測方法。本發明采用重亞硫酸鹽轉化后的甲基化DNA為模板，進行兩輪PCR擴增反應。通過磁珠特異捕獲目標片段，并使用SAPE對其進行熒光標記，最后使用液相芯片檢測平臺檢測熒光信號。本發明可以用于同步檢測多達100種基因甲基化位點，且有高準確度、高敏感性以及高檢測通量等特點，可以解決現有技術成本高、難以檢測多位點以及檢測精度不高等問題。本發明所述的方法可應用于在各領域1?100個基因位點聯合的甲基化檢測，包括但不限于疾病診斷、司法鑒定、科研服務等。

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種DNA甲基化多基因位點聯合檢測方法及其應用。

背景技術

DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳學修飾，人基因組中甲基化幾乎只發生在CpG二核苷酸。在DNA甲基轉移酶的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到CpG島5＇胞嘧啶上，生成5＇甲基胞嘧啶。當基因啟動子區的CpG島區域發生非正常高甲基化時，該基因的轉錄和表達就會受到抑制，引起疾病的發生。

根據檢測的目的不同，檢測DNA甲基化的方法主要分為兩類：一類是檢測特定的甲基化位點，包括甲基化敏感限制性內切酶-Southern印記雜交技術、重亞硫酸鹽修飾后測序法、甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(C0BRA)等技術。

其中甲基化敏感限制性內切酶-Southern印記雜交技術是通過利用甲基化敏感的限制性內切酶只切割非甲基化DNA片段，而不切割甲基化DNA片段的特性。利用兩種不同的內切酶對DNA片段進行切割，用帶有放射性標記的探針對DNA片段進行雜交，比較條帶來得到目的位點的甲基化狀態。這種方法因為涉及酶切反應，需要控制時間溫度，操作復雜，靈敏度有限，且很難甚至不能得到多基因位點的甲基化水平，所以難以在臨床診斷方面進行推廣。

重亞硫酸鹽修飾高通量測序法是利用非甲基化胞嘧啶可以被重亞硫酸鹽修飾轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變的特性。將目的片段修飾后，再進一步通過高通量測序技術比較待測片段中的甲基化情況。這種方法分辨率雖高，但是由于要進行高通量測序，費用成本過高，得到信息冗余。并且所需待檢DNA樣本量較大，同樣不適用于臨床推廣。

甲基化特異性PCR同樣利用重亞硫酸鹽對目的片段進行修飾，針對修飾后的甲基化或非甲基化DNA分別設計檢測引物，進行PCR擴增反應。若用甲基化片段設計得到的引物可以擴增出片段，說明該檢測位點發生了甲基化，反之亦然。這種方法雖然具有較高的特異性和靈敏度，但是該方法一般只能檢測單個DNA甲基化位點，擴增過程容易產生假陽性信號，臨床應用受限。

亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(COBRA)首先也是將目的片段進行重亞硫酸鹽修飾，對修飾后的片段進行PCR擴增后使用限制性內切酶酶切PCR產物，根據電泳條帶的不同位置以及亮度檢測甲基化的狀態和程度。這種方法雖簡便，可定量，但是由于檢測位點受限，不能排除假陰性的可能，亦無法用于臨床應用。

第二類是檢測基因組總體的甲基化水平，包括變性高液相色譜法(DHPLC)、基于抗5mC的免疫化學法、甲基轉移酶法(M.Sssl)等。

其中變性高液相色譜法利用DNA序列中GC含量和DNA失配情況來確定DNA片段被色譜柱保留的時間。序列中CpG位點的甲基化導致PCR產物中的GC含量比未甲基化基因的含量增加，導致更高的熔融溫度，增加了保留時間。所以在部分變性的條件下，通過檢測由重亞硫酸鹽處理的DNA片段保留時間，可以顯示DNA甲基化的差異。這種方法可以對DNA甲基化進行定量檢測，但是由于操作復雜，無法定位基因位點且不夠精確，應用受到限制。

抗5mC的免疫化學法是基于5mC抗體能夠與5mC發生特異性反應所設計的方法。首先應用熒光素標記該抗體使之與預先已固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結合，對DEAE膜上的熒光素進行測量，熒光素的強度與5mC的水平成正比。這種方法主要依靠于抗體的設計，而抗體的設計又較為困難，同樣不易推廣使用。