[發明專利]基于LAPS和ZnO納米棒陣列無標簽檢測大腸桿菌O157:H7DNA的裝置及方法

有效

• 申請號: 201911143163.4
• 申請日: 2019-11-20
• 公開（公告）號: CN110849957B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 吳春生;田玉蘭;朱平;陳雅婷;杜立萍
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48;C12Q1/689;C12Q1/6806;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 朱海臨

1.基于LAPS和ZnO納米棒陣列無標簽檢測大腸桿菌O157:H7DNA的裝置，其特征在于，包括法拉第屏蔽箱(1)、裝載臺(2)、半導體激光器(3)、LAPS傳感器(4)、恒壓器(5)、鎖相放大器(6)、采集卡(7)和計算機(8)；其中，裝載臺(2)置于法拉第屏蔽箱(1)內，半導體激光器(3)安裝在裝載臺(2)下方，LAPS傳感器(4)安裝在裝載臺(2)上，恒壓器(5)和鎖相放大器(6)設置在法拉第屏蔽箱(1)中，且恒壓器(5)和鎖相放大器(6)與LAPS傳感器(4)上的電極連接，鎖相放大器(6)和采集卡(7)連接，采集卡(7)安裝在計算機(8)上，用于對LAPS傳感器(4)光電流進行采集，所述計算機(8)安裝在法拉第屏蔽箱(1)外側；

所述LAPS傳感器(4)包括合金板(10)，合金板(10)的中部位置上依次設置有大小相同的Si層(14)、SiO₂層(15)及Al層(16)，Al層(16)設置有中間窗口，且Al層(16)中部位置上依次設置有大小相同的ZnO NRAs層(17)和探針ssDNA層(18)，且Si層(14)、SiO₂層(15)、Al層(16)、ZnO NRAs層(17)和探針ssDNA層(18)均設置在LAPS檢測腔(9)中；

Al層(16)的外沿設置有參考電極(12)和對電極(13)，合金板(10)的外沿設置有工作電極(11)，且工作電極(11)位于LAPS檢測腔(9)外側，工作電極(11)、參考電極(12)和對電極(13)與恒壓器(5)相連，鎖相放大器(6)與工作電極(11)相連。

2.基于LAPS和ZnO納米棒陣列無標簽檢測大腸桿菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：大腸桿菌O157:H7 DNA的制備：以大腸桿菌O157:H7 eaeA基因為材料，采用不對稱聚合酶鏈反應的方法制備目標DNA；

具體包括：

步驟1.1：將大腸桿菌O157:H7在37℃的營養肉湯中培養12小時，放入100℃水浴15分鐘；

步驟1.2：利用細菌DNA試劑盒提取步驟1.1得到的大腸桿菌O157:H7的基因組DNA；

步驟1.3：以提取的基因組DNA為模板利用PCR將反向引物濃度設置為正向引物濃度的50倍，大腸桿菌O157:H7 eaeA基因特異的正向和反向引物為5'-GGCGG ATAAG ACTTCGGCTA-3'和5'-CGTTT TGGCA CTATT TGCCC-3'，采用Bio-Rad熱循環儀進行不對稱PCR反應，預孵育5分鐘，然后進行40個循環，其中95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后延伸10秒，產物為大腸桿菌O157:H7 eaeA基因的短DNA片段，包含能夠與探針ssDNA互補的堿基序列；

步驟2：LAPS傳感器制作及ZnO納米棒的修飾；

具體為：

步驟2.1：將厚度為400um的P型硅片作為基底，所述P型硅片電導率為1-10Ωcm，采用熱氧化法在P型硅片表面制備厚度為30nm的SiO₂層，在SiO₂層上修飾一層中間窗口圖案厚度為300nm的Al層；

步驟2.2：采用水熱法在Al層的中部位置修飾一層ZnO NRAs，形成ZnO NRAs層；

步驟2.3：將探針ssDNA分子經硅烷化過程共價固定于ZnO NRAs層上，形成探針ssDNA層，整體作為LAPS芯片；

步驟2.4：將LAPS芯片放入檢測腔內，LAPS傳感器制備完成；

步驟3：在LAPS傳感器表面修飾探針鏈DNA，掃描LAPS光電流-電壓曲線，記為I-V曲線，通過遍歷及最小二乘法擬合出檢測O157:H7 DNA濃度的最佳標定曲線；

步驟4：通過分析待測樣品溶液的I-V曲線，得到電壓偏移量V，帶入最佳標定曲線中，計算出待測樣品的濃度。