[發(fā)明專利]一種北芪菇蛋白源抗氧化肽的制備方法

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• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110904176A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦楠;劉星;張朔生;繆文玉;郭麗麗;王小敏
• 申請（專利權(quán)）人: 山西中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種北芪菇蛋白源抗氧化肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1：堿溶酸沉法提取北芪菇蛋白，具體步驟如下：

1)將曬干的北芪菇放入粉碎機中打磨成粉，稱取5g的北芪菇干粉，加60ml蒸餾水于100ml試管中充分溶解，用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至8.0；

2)將溶液移入兩個50ml相同規(guī)格的離心管中，放入離心機中，調(diào)整離心速度為2700r/min，開始離心，5min后取出，轉(zhuǎn)移上清液至100ml試管中，加鹽酸將pH值調(diào)至4.5；

3)再次調(diào)整離心速度為5000r/min，開始離心，15min后取出，去掉上清液，得到蛋白質(zhì)沉淀物；

S2：北芪菇蛋白的酶解，具體步驟如下：

1)配制濃度2％的北芪菇蛋白溶液，在pH為7-8，溫度在35-45℃條件下，根據(jù)加酶量加入蛋白酶，放入恒溫水浴鍋中水解1-2h；

2)放入95℃的水浴鍋中滅酶15min，最后以5000r/min的速度離心15min得到上清液，此上清液即是北芪菇蛋白酶解液；

S3：蛋白酶的篩選，具體步驟如下：

1)選取了木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在濃度2％，酶解時間2h，加酶量5000U/g，進行酶解試驗；

2)將檢測指標設(shè)定為DPPH自由基清除率和水解度，篩選得到兩種最佳蛋白酶；

S4：加酶方式的選擇，具體步驟如下：

1)在篩選出最佳的兩種蛋白酶之后，兩種酶在各自最適溫度和pH值下水解，以及兩種酶以1∶1混合，在兩種酶各自最適溫度和pH值下分別水解，水解條件為濃度2％，酶用量5000U/g，時間2h；

2)測定水解度指標并記錄，測定抗氧化肽的DPPH自由基清除率指標并記錄，得到最佳加酶方式；

S5：加酶比例的選擇，具體步驟如下：

1)確定加酶方式以后，選擇兩種酶的加酶比例，其他條件為濃度2％，酶用量5000U/g，時間2h；

2)測定水解度指標并記錄，測定抗氧化肽的DPPH自由基清除率指標并記錄，得到最適合的加酶比例；

S6：單因素試驗，具體步驟如下：

1)在確定了兩種最佳蛋白酶，加酶方式和加酶比例以后，配制2％濃度的北芪菇蛋白溶液，進行單因素試驗；

2)在溫度40℃，pH7.5，時間2h的條件下，研究加酶量對DPPH自由基清除率的波動情況并記錄和對水解度的波動情況并記錄；

3)在溫度40℃，酶量5000U/g，時間為2h的條件下，研究pH值對DPPH自由基清除率的波動情況并記錄和對水解度的波動情況并記錄；

4)在pH值為7.5，酶量5000U/g，時間為2h的條件下，研究溫度對DPPH自由基清除率的波動情況并記錄和對水解度的波動情況并記錄；

5)在pH值為7.5，酶量5000U/g，溫度40℃的條件下，研究時間對DPPH自由基清除率的波動情況并記錄和對水解度的波動情況并記錄；

S7：響應(yīng)面試驗，具體步驟如下：

1)做好單因素試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析，確定最佳范圍，以DPPH自由基清除率為因變量，四個因素分別是加酶量，溫度，pH，時間，進行四因素三水平試驗，根據(jù)響應(yīng)面模擬軟件，確定響應(yīng)面試驗方案；

S8：DPPH自由基清除率的測定，具體步驟如下：

1)在100ml容量瓶中加入無水乙醇，稱取的DPPH試劑，制得濃度為6.6*10-4mol/L的DPPH溶液；

2)在低溫和避光環(huán)境下保存，使用時用無水乙醇稀釋到濃度6.6*10^-5mol/L，加樣并震蕩，混合均勻后在避光環(huán)境下保存30min；

3)在517nm處測定吸光度，每過三分鐘測一次，直至吸光度值保持穩(wěn)定，每一吸光度值需要進行三次重復(fù)試驗以減小誤差；

S9：水解度的測定，具體步驟如下：

1)采用pH-stat滴定法測定水解度，當在堿性條件下水解時，蛋白質(zhì)中的肽鍵會斷裂，pH值下降；

2)用稀濃度堿液將溶液pH值調(diào)回初始pH值所用的堿量可以計算出水解度

S10：ABTS和清除率試驗，具體步驟如下：

1)配制pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液：取氯化鈉1.975g，氯化鉀0.05g，磷酸二氫鉀0.06g，磷酸氫二鉀0.45g，用200ml蒸餾水溶解，均勻攪拌，用pH計測得pH為7.2，4℃冰箱保存；

2)配制2.45mmol/L過硫酸鉀溶液：取過硫酸鉀26.4914mg，用40ml磷酸鹽緩沖溶液溶解，攪拌均勻；

3)配制7mmol/L ABTS+·溶液：取2，2’-聯(lián)氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·)153.6304mg，用40ml磷酸鹽緩沖溶液溶解，攪拌均勻；

4)取上述配制好的過硫酸鉀溶液、ABTS+·溶液按1∶1混勻，避光環(huán)境下保存12-16h，用磷酸鹽緩沖溶液去稀釋至吸光度值為0.70±0.02，于734nm處測定吸光度值；

S11：總還原力試驗，具體步驟如下：

1)制備pH6.6的PBS緩沖液：稱取磷酸二氫鉀1.74g，氯化鈉1.7g，磷酸氫二鉀2.7g，加入蒸餾水溶解成400ml即得；

2)用pH計測得pH為6.6，4℃冰箱中保存，取2ml的待測液加入pH 6.6的PBS緩沖液2.5ml和1％鐵氰化鉀溶液2.5ml，混合后在50℃條件下水浴放置20min，冷卻后加入10％的三氯乙酸溶液1ml，5000r/min離心10min，取上層清液2.5ml，加入2.5ml蒸餾水和0.5ml0.1％三氯化鐵溶液，混勻；

3)放置10min后在700nm波長處測定吸光度，以80％的乙醇溶液作為空白組對照，以待測液與空白組對照吸光度的差值為樣品的還原能力，以抗壞血酸作為標準對照品進行測定；

S12：分析計算，使用Design-Expert8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。